Le rôle de p27Kip1 dans la mitose et dans l'instabilité génétique

Roles of p27Kip1 in mitosis and in genetic instability

• Auteur / Autrice : Renaud Perchey
• Direction : Arnaud Besson, Anastassia Hatzoglou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Cancérologie
• Date : Soutenance le 25/06/2019
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mitose

Inhibiteurs des kinases dépendantes des cyclines

Régulation cellulaire

Mots clés libres

P27Kip1

Citron-kinase

Citron-kinase

PRC1

CDK1

Mitose

Cytocinèse

Microtubule

Instabilité génétique

Binucléation

Mitosis

Cytokinesis

Microtubule

Genetic instability

Binucleation

Résumé

L'avancée du cycle cellulaire est régulée par l'activation séquentielle des complexes cycline/CDK. Un niveau de régulation de ces complexes est médié par leur association avec leurs inhibiteurs, les CKIs dont p27Kip1 (p27). p27 est donc un inhibiteur du cycle de division cellulaire, ce qui lui confère un rôle de suppresseur de tumeur. Cependant, dans certains contextes, notamment lorsque p27 est localisé dans le cytoplasme, p27 a des fonctions oncogéniques. En effet, en plus de ses rôles dans la régulation des complexes cycline/CDK, p27 possède de multiples rôles CDK-indépendants et est impliqué dans le contrôle de divers processus comme la migration, la transcription, l'autophagie et la cytocinèse. La détermination de l'intéractome de p27 a montré que plusieurs protéines jouant des rôles clés dans la cytocinèse peuvent interagir avec p27, dont PRC1 (Protein Regulating Cytokinesis 1) et Citron-Kinase. Les objectifs de ma thèse sont de comprendre comment p27 participe au contrôle de la cytocinèse via son interaction avec ces deux protéines. Régulation de l'activité de PRC1 par p27Kip1 PRC1 est nécessaire à la formation du fuseau central en début d'anaphase via son interaction avec les microtubules et d'autres partenaires. Pour ce projet, mes objectifs étaient de confirmer l'interaction de PRC1 avec p27, de cartographier les domaines d'interactions, de déterminer si p27 pouvait réguler l'activité de PRC1 et par quel mécanisme, et enfin les conséquences de cette régulation au niveau cellulaire. J'ai confirmé l'interactions de p27 avec PRC1 dans différents modèles cellulaires et identifié les domaines d'interactions respectifs. J'ai mis en évidence par une technique de sédimentation des microtubules assemblés in vitro que p27 empêche l'interaction de PRC1 avec les microtubules. J'ai pu mettre en évidence deux phénotypes. D'une part la surexpression de PRC1 induit une fasciculation excessive et massive des microtubules qui est abolie par la co-expression de p27. Par ailleurs, la surexpression de PRC1 induit la binucléation et la co-expression de p27 empêche la binucléation induite par PRC1. Ce phénotype est révélateur d'un échec de la cytocinèse et suggère un rôle CDK-indépendant de p27 durant cette phase. Régulation de Citron-Kinase par CDK1 et p27Kip1 Nous avions déjà démontré que p27 interagit avec Citron-Kinase (CitK). CitK a un rôle essentiel dans la cytocinèse, sa déplétion induit un échec de cytocinèse. CitK est impliqué dans les dernières étapes de la cytocinèse (abscission), notamment en tant que protéine de structuration permettant de faire un lien entre la membrane plasmique et l'anneau contractile. Les mécanismes de régulation de CitK restent mal connus et il est important de comprendre comment cette protéine essentielle pour le déroulement de la cytocinèse est régulée. Dans notre étude de 2012, un mutant p27CK-, qui n'interagit pas avec les complexes cycline/CDK et n'est pas dégradé correctement par le protéasome, induit un phénotype de multinucléation en interférant avec l'activité de CitK, notamment via la régulation de l'interaction CitK/RhoA. Nous pensions initialement que l'accumulation de p27CK- en G2/M était responsable de ce phénotype.

Progression through the cell cycle is regulated by the sequential activation of cyclin/CDK complexes. One level of regulation of these complexes is provided by their association with their inhibitors, the CKIs, which include p27Kip1 (p27). p27 is therefore an inhibitor of the cell division cycle, in this way, p27 acts as a tumor suppressor. However, in certain contexts, and especially when p27 is located in the cytoplasm, p27 has oncogenic functions. It appears that in addition to its role in the regulation of cyclin/CDK complexes, p27 has multiple CDK-independent roles and is involved in the control of various cellular processes such as migration, transcription, autophagy and cytokinesis. Determination of the interactome of p27 revealed that several proteins playing an essential role in cytokinesis could interact with p27, including PRC1 (Protein Regulating Cytokinesis 1) and Citron-Kinase (CitK). The objectives of my thesis are to understand how p27 participates in the control of cytokinesis via its interaction with these two proteins. Regulation of PRC1 activity by p27Kip1 PRC1 is necessary for the formation of the central spindle at the beginning of anaphase via its interaction with microtubules and other partners. For this project, my objectives were to confirm the p27/PRC1 interaction, to map the interaction domains on each partner, to test whether p27 could regulate PRC1 activity and determine by which mechanism, as well as the cellular consequences of this regulation. I validated the interactions in different cells models and identified the respective interaction domains. I found by a microtubule sedimentation technique in vitro that p27 prevents the interaction of PRC1 with microtubules. I was able to uncover two phenotypes. First, PRC1 overexpression induces excessive and massive microtubule bundling, which is abolished by co-expression of p27. Second, PRC1 overexpression causes binucleation and p27 co-expression prevents PRC1-induced binucleation. This phenotype is indicative of cytokinesis failure and suggests a CDK-independent role of p27 during cytokinesis. Citron-Kinase regulation by CDK1 and p27Kip1 Another p27 interactor previously reported by my team is CitK. CitK plays an essential role in cytokinesis and its depletion induces cytokinesis failure. CitK is involved in the final stages of cytokinesis (abscission), notably as a scaffold protein that bridges the plasma membrane and the contractile ring. The regulatory mechanisms of CitK remain poorly understood and it appears important to understand how this protein playing an essential role in cytokinesis is regulated. In our 2012 study, a p27CK- mutant, that cannot bind and inhibit cyclin-CDK complexes and is not degraded correctly by the proteasome, induced a phenotype of multinucleation by interfering with CitK activity, notably via the regulation of the CitK/RhoA interaction. We initially thought that the accumulation of p27CK- in G2/M drove this phenotype. However, our current data suggest that although the total amount of p27CK- is elevated, the amount of p27CK- at the midbody are similar to that of p27WT, suggesting that p27CK- lacks a feature that p27WT has. Since the only difference between p27WT and p27CK- is the ability to bind and inhibit cyclin/CDK complexes, we hypothesized that CitK can be regulated by CDK1 and that p27 participates in this regulation. My work has shown that CitK interacts with CDK1/Cyclin B1 in different cells lines.