Suivi du changement conformationel de protéines membranaires de la chaîne respiratoire par sondes infrarouge

Infrared spectroscopic study of the conformational movements in membrane proteins from the respiratory chain by introducing a CN label in critical positions

• Auteur / Autrice : Ana Filipa Santos Seiça
• Direction : Petra Hellwig
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 11/12/2019
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences chimiques (Strasbourg ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie de la matière complexe (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : Fouzia Boulmedais
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Petra Hellwig, Fouzia Boulmedais, Klaus Fendler, Sophie Lecomte
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Klaus Fendler, Sophie Lecomte

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sondes moléculaires

Spectroscopie infrarouge

Analyse conformationnelle

Protéines membranaires

Mots clés libres

Marqueurs infrarouge

Complex I

GlcPSe

LacY

SEIRAS

Surface d’or

F1FO-ATPase

Infrared markers

F1FO-ATPase

Complex I

GlcPSe

LacY

SEIRAS

Gold surface

Résumé

Dans cette thèse 2, différentes bandes marqueurs en infrarouge de la protéine ont été étudiées, la ν(C=O) Asp/Glu entre 1730-1750 cm-1 et la ν(SC≡N) entre 2175-2120 cm-1 par spectroscopie infrarouge exaltée de surface. Les sondes infrarouges ont été introduites dans les protéines membranaires de la chaîne respiratoire. Ainsi les grands mouvements des domaines protéiques gouvernant les mécanismes catalytiques ont été contrôlés par les spectroscopies vibrationnelles à l'aide d’une réaction induite. Avant d'étudier les marqueurs infrarouges, il était nécessaire de comprendre, d’une part, l'influence de la morphologie de la surface d’or nanostructurée et d’autre part, l’effet de la procédure d'immobilisation des protéines sur le facteur d'amélioration des signaux protéiques en infrarouge. Deux méthodes d'immobilisation ont été utilisées pour caractériser des cristaux de silicium après dépôt de nanoparticules métalliques à des temps de dépôt différents. La première protéine marquée par une sonde infrarouge est la F1FO-ATPase d’Escherichia coli, composée de deux parties distinctes reliées par deux tiges. Il y a des études révélant la participation de la sous-unité epsilon (ε) dans la production de l'ATP. Cette sous-unité a été observée en deux conformations différentes en fonction des conditions expérimentales, cependant, il n'y a aucune preuve directe. Le signal thiocyanate a été étudié en présence et en absence d'ATP dans les deux protéines mutantes situées dans différentes positions de la sous-unité ε. La deuxième protéine étudie c’était le Complex I. Le mouvement de la sonde infrarouge nitrile, petite et très flexible a été attaché à l'hélice amphipathique située dans le bras membranaire de E coli. Complexe I. Nous avons permis de démontrer une nouvelle façon d'identifier les changements conformationnels dans cette enzyme. Le deuxième sonde étudié en infrarouge correspond à la ν(C=O) du glucose Staphylococcus epidermidis/H+ symporteur (GlcPSe) et Lactose Permease (LacY) d’Escherichia Coli. La spectroscopie d'absorption infrarouge d’exaltation de surface (SEIRA) a été utilisée pour étudier les changements conformationnels de la GlcPSe et LacY immobilisée à la surface et liée d’une manière dépendante au pH- et au glucose. Les résultats ont révélé que l’Asp22 de GlcPSe possède un pKa de 8.5 en présence et en absence du glucose. Pour la protéine LacY, l'importance critique de Glu325 et la possibilité que l'Arg302 puisse être important pour la déprotonation, a été étudié pour les mutants dans le voisinage immédiat de Glu325

In this thesis, 2 different infrared marker bands of the protein were studied, ν(C=O) Asp/Glu between 1730-1750 cm-1 and ν(SC≡N) between 2175-2120 cm-1 by surface exalted infrared spectroscopy. Infrared probes were introduced into membrane proteins in the respiratory chain. Large movements of the protein domains governing the catalytic mechanisms were controlled by vibrational spectroscopy using an induced reaction. Before studying infrared markers, it was necessary to understand the influence of the morphology of the nanostructured gold surface and the effect of the protein immobilization procedure on the enhancement factor of infrared protein signals. Two immobilization methods were used to characterize silicon crystals after deposition of gold nanoparticles at different deposition times. The first protein labeled with an infrared probe was Escherichia coli F1FO-ATPase, which consists of two distinct parts connected by two stems. This subunit was observed in two different conformations depending on the experimental conditions, however, there is no direct evidence. The thiocyanate signal was studied in the presence and absence of ATP in two residues of the protein located in different positions of the ε subunit. The second protein studied was Complex I. The small and very flexible nitrile infrared probe was attached to the amphipathic helix located in the membrane arm of E coli. Complex I. This allowed us to demonstrate a new way of identifying conformational changes in this enzyme. The second probe studied in infrared was the ν(C=O) of the glucose Staphylococcus epidermidis/H+ symporter (GlcPSe) and Lactose Permease (LacY) of Escherichia Coli. Surface-enhanced Infrared Absoprtion Spectroscopy (SEIRA) was used to study conformational changes in surface-immobilized GlcPSe and LacY bound in a pH- and glucose-dependent manner. Results showed that Asp22 of GlcPSe had a pKa of 8.5 in the presence and absence of glucose. For the LacY the critical importance of Glu325 and the possibility that Arg302 may be important for deprotonation, were studied for the mutants in the immediate vicinity of Glu32.