ALIX / Syntenin / Syndecan-4 : un couplage entre la machinerie ESCRT et la membrane plasmique requis pour la cytocinèse

ALIX / Syntenin / Syndecan-4 : an ESCRT-to-membrane coupling required for completion of cytokinesis

• Auteur / Autrice : Cyril Addi
• Direction : Arnaud Echard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 20/09/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Trafic membranaire et Division cellulaire - Membrane Traffic and Cell Division
• Jury : Président / Présidente : Joëlle Sobczak
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Juliette Mathieu, Pascale Zimmermann
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jeremy Carlton, Roland Le Borgne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines membranaires

Division cellulaire

Cytodiérèse

Mots clés libres

Cytocinèse

Abscission

ESCRT

ALIX

Syntenin

Syndecan

Division cellulaire

Cytodiérèse

Cytokinesis

Abscission

ESCRT

ALIX

Syntenin

Syndecan

Cell division

Cytodieresis

Résumé

La cytocinèse est l’étape finale de séparation des deux cellules filles, après la mitose. Elle commence avec la formation d’un sillon de clivage, généré par un anneau d’actomyosine, menant à la formation d’un pont intercellulaire dont le centre est dénommé « midbody ». Les mécanismes qui mènent à l’abscission sont encore largement incompris, mais le modèle actuellement retenu fait intervenir la polymérisation de filaments d’ESCRT-III. Ces protéines sont en particulier localisées au niveau des sites d’abscission et sont nécessaires à la coupure du pont intercellulaire. On ne sait pas si ces protéines ESCRT-III interagissent avec une protéine membranaire dans le cadre de la cytocinèse, comme c’est le cas dans d’autres événements topologiquement équivalents où les ESCRT-III sont impliquées, comme par exemple le bourgeonnement du VIH ou la formation des exosomes. Dans ce dernier cas, Synténine est connue pour agir comme un adaptateur entre les protéines transmembranaires Syndécans et les protéines ALIX/ESCRT-III, ce qui est nécessaire pour la scission des exosomes à l’intérieur des corps multivésiculaires. Avant mon arrivée, le laboratoire TMDC a purifié et analysé par spectrométrie de masse des « midbody remnants » de cellules HeLa, une structure résiduelle générée après l’abscission. Cette analyse a mis en évidence l’enrichissement d’environ 500 protéines dans ces « midbody remnants », dont une grande partie n’avaient jamais été décrites comme requises pour la cytocinèse, en particulier Synténine et Syndécan-4. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du couple Synténine/Syndécan-4 dans les dernières étapes de la cytocinèse, d’autant plus qu’aucune protéine transmembranaire n’a pour le moment été étudiée dans le cadre de l’abscission. Des expériences d’immunofluorescence sur des ponts intercellulaires de cellules HeLa ont montré que les protéines endogènes Syndécan-4, Synténine, ALIX et CHMP4B (une protéine du complexe ESCRT-III) colocalisent au niveau du midbody et sur son côté, au site d’abscission. En vidéomicroscopie, mScarlet-Synténine et GFP-Syndécan-4 sont d’abord recrutées au midbody, puis dans un deuxième temps, sont enrichies au site d’abscission, comme ce qui a déjà été montré pour les protéines ESCRT-III. Au niveau mécanistique, ALIX est nécessaire au recrutement de Synténine au pont intercellulaire, et Synténine est elle-même nécessaire au bon recrutement de Syndécan-4. D’un point de vue fonctionnel, la déplétion d’ALIX, de Synténine ou de Syndécan-4 retarde fortement l’abscission et empêche le recrutement stable des protéines ESCRT-III au site d’abscission. L’ensemble de ces résultats montre qu’ALIX, Synténine et Syndécan-4 interagissent dans le cadre de la cytocinèse et qu’ils permettent la bonne localisation des protéines ESCRT-III au niveau du site d’abscission. Syndecan-4 est la première protéine transmembranaire directement impliquée dans l’abscission ; je propose que cette protéine couple les forces générées par les filaments d’ALIX/ESCRT-III et la membrane, ce qui permet la scission effective du pont intercellulaire.

Cytokinesis is the final step that mediates the separation of the two daughter cells after mitosis. It begins with the formation of a cleavage furrow, generated by an actomyosin ring, which leads to the formation of an intercellular bridge whose center is called the ''midbody''. The mechanisms that lead to abscission are not fully understood, but the commonly accepted model involves the polymerization of ESCRT-III filaments. In particular, these proteins are localized at the abscission sites and are required for the severing the intercellular bridge. It is not known whether these ESCRT-III proteins interact with a membrane protein in the context of cytokinesis, as it has been shown in other topologically equivalent events in which ESCRT-III are involved, such as HIV budding or biogenesis of exosomes. In the latter case, Syntenin is known to act as an adapter between the transmembrane proteins Syndecans and the ALIX / ESCRT-III proteins, and this is required for the proper release of exosomes within the multivesicular bodies. Before my arrival, the laboratory had purified and analyzed by mass spectrometry ''midbody remnants'' of HeLa cells, a midbody released after abscission. This analysis revealed the enrichment of approximately 500 proteins in the ''midbody remnants'', a large part of which had never been shown to be required for cytokinesis, in particular Syntenin and Syndecan-4. The aim of my thesis was to determine the role of the Syntenin / Syndecan-4 couple in the last stages of cytokinesis, especially because no transmembrane protein has yet been studied in the context of cytokinetic abscission. Immunofluorescence experiments on intercellular bridges of HeLa cells showed that the endogenous proteins Syndecan-4, Syntenin, ALIX and CHMP4B (a protein of the ESCRT-III complex) colocalize at the midbody and on its side, at the site of abscission. In videomicroscopy, mScarlet-Syntenin and GFP-Syndecan-4 are first recruited to the midbody, and then, in a second step, are enriched at the abscission site, as it has already been shown for ESCRT-III proteins. From a mechanistic point of view, ALIX is required for the recruitment of Syntenin at the intercellular bridge, and Syntenin is itself required for the proper recruitment of Syndecan-4. From a functional point of view, the depletion of ALIX, Syntenin or Syndecan-4 strongly delays abscission and prevents the stable recruitment of ESCRT-III proteins at the abscission site. All these results show that ALIX, Syntenin and Syndecan-4 interact together in the context of cytokinesis and that they allow the proper localization of ESCRT-III proteins at the abscission site. Syndecan-4 is the first transmembrane protein directly involved in abscission; I propose that this protein couples the forces generated by the ALIX / ESCRT-III filaments to the plasma membrane, and therefore promotes the scission of the intercellular bridge.