Vers le développement d'une thérapie génique pour la maladie de Pompe : Caractérisation du phénotype immunitaire de la maladie de Pompe et comparaison du potentiel thérapeutique de la thérapie génique avec le traitement standard actuel

Towards the development of a gene therapy for Pompe disease : Characterization of the immune phenotype in Pompe disease and comparison of the therapeutic potential of gene therapy with the current standard of care

• Auteur / Autrice : Helena Costa Verdera
• Direction : Gillian Butler-Browne, Federico Mingozzi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Thérapie génique et immunologie
• Date : Soutenance le 10/12/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche en myologie (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Sébastien Lacroix-Desmazes
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Francesca Fallarino
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gloria González Aseguinolaza, Catalina Abad

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thérapie génique

Enzymothérapie

Maladie de Pompe

Mots clés libres

Thérapie enzymatique substitutive

Thérapie génique

Vecteur viral adéno-associé

Maladie de Pompe

Phosphorylation oxydative

Glycolyse

Autophagie

Lyosome

Enzyme replacement therapy

Gene therapy

Lysosomal storage disease

Résumé

La maladie de Pompe est une maladie lysosomale causée par des mutations sur l'enzyme α-glucosidase acide (GAA), responsable de la dégradation du glycogène lysosomal. Le déficit en GAA provoque l'accumulation de glycogène dans de multiples tissus, conduisant à une maladie neuromusculaire complexe avec une morbidité et mortalité élevées. En plus des symptômes connus, nos études montrent que le déficit en GAA affecte l’activation et le fonctionnement des cellules immunitaires chez les patients et le modèle murin de la maladie de Pompe. En particulier, nous avons observé une suractivation des cellules T effectrices, ainsi qu’un défaut dans l’induction et la fonction des cellules T régulatrices (Tregs). De plus, les souris atteintes de la maladie de Pompe présentent de l’inflammation tissulaire précoce, ce qui pourrait contribuer à la physiopathologie de la maladie. Ces résultats pourraient ouvrir des nouvelles voies pour étudier des stratégies qui retardent la progression de la maladie. Dans une deuxième série d'expériences, nous montrons qu'une thérapie génique ciblée au foie avec un transgène GAA sécrétable conduit à une meilleure correction de la maladie dans un modèle murin immunodéficient de la maladie, par rapport au traitement enzymatique substitutif existant. Étant donné que les Treg jouent un rôle essentiel dans la thérapie génique ciblée au foie, en induisant une tolérance immunitaire vers les transgènes hépatiques, de futures études devront évaluer l'impact des altérations immunitaires associées à cette maladie sur l'efficacité de la thérapie génique.

Pompe disease is a lysosomal storage disease caused by mutations on the enzyme acid α-glucosidase (GAA), responsible for degrading lysosomal glycogen. GAA deficiency causes the accumulation of glycogen in multiple tissues, particularly in muscles and central nervous system, leading to a complex neuromuscular disease with high morbidity and mortality. In addition to the known symptoms, our studies in Pompe disease patients and mice show that GAA deficiency affects the activation and function of immune cells, particularly of T cells, leading to a higher activation of effector cells and impaired induction and suppressive function of regulatory T cells (Tregs). Moreover, Pompe disease mice present tissue inflammation at early stages of the disease, altogether suggesting that alterations in the immune system could contribute to the disease pathophysiology. These findings could open new venues to investigate strategies that delay the progression of the disease. In a second set of experiments we show that liver-directed gene therapy with a secretable GAA transgene results in superior disease rescue in an immunodefficient Pompe disease mouse model, when compared to the current enzyme replacement therapy. Because Tregs play an essential role in liver-directed gene therapy, by inducing immune tolerance towards hepatic transgenes, future studies will have to evaluate the potential impact of immune alterations associated to Pompe disease on the efficacy of liver-targeted gene transfer.

La enfermedad de Pompe es una enfermedad lisosomal (lysosomal storage disease, LSD) causada por mutaciones en la enzima α-glucosidasa ácida (GAA), que hidroliza el glucógeno en glucosa en los lisosomas. La disfunción de esta enzima causa la acumulación de glucógeno en múltiples tejidos, principalmente en células musculares y neuronas. Como resultado, los pacientes desarrollan hipertrofia cardíaca, debilidad muscular, insuficiencia respiratoria, alteraciones cognitivas y muerte prematura por paro cardiorrespiratorio. Actualmente la enfermedad de Pompe se trata con terapia de reemplazo enzimático (Enzyme replacement therapy, ERT) con GAA recombinante humana (rhGAA). Este tratamiento ha demostrado corregir la patología cardíaca y extender la esperanza de vida de los pacientes. Sin embargo, la eficacia de la ERT en los músculos respiratorios y esqueléticos es parcial, y nula en el sistema nervioso central (SNC). Además, la proteína rhGAA es altamente inmunogénica, por lo que el tratamiento no es efectivo en ciertos pacientes. Otros inconvenientes son el elevado coste de la ERT y la necesidad de infusiones continuadas a lo largo de la vida del paciente. En este estudio mostramos que la terapia génica dirigida al hígado mediante vectores adeno-asociados (AAV) expresando una versión modificada de la GAA revierte de forma significativa la enfermedad a nivel de la musculatura esquelética y del SNC, en un modelo animal de la enfermedad de Pompe. Además, mostramos que este tratamiento es superior en eficacia al tratamiento estándar por ERT, incluso a dosis reducidas de vector AAV. Con tal de comprender mejor los mecanismos de acción de estos dos tratamientos, hemos llevado a cabo un estudio farmacocinético de los niveles de GAA en circulación y en múltiples tejidos en los dos casos. Dicho estudio muestra que niveles reducidos pero constantes de GAA en circulación proporcionados por el hígado permiten una mayor acumulación de GAA en los tejidos en comparación a la ERT, mejorando así la eficacia del tratamiento. Debido a que las reacciones inmunes contra el vector AAV y el transgén son un obstáculo importante en la aplicación clínica de la terapia génica, y a que alteraciones en los lisosomas han demostrado tener un impacto sobre el sistema inmune en diferentes modelos, también hemos estudiado el sistema inmune en el caso de la enfermedad de Pompe. Mediante estos estudios, hemos observado que la acumulación de glucógeno en los lisosomas de células inmunes está asociada a una mayor activación de estas células, tanto en pacientes como en ratones con enfermedad de Pompe, y particularmente en las células T. Además, ratones con enfermedad de Pompe presentan inflamación en los tejidos ya en las primeras etapas de la enfermedad. Por otra parte, mostramos que el mayor estado de activación de las células T podría deberse a alteraciones en el metabolismo de estas células, como resultado de las alteraciones lisosómicas. Finalmente, los ratones con enfermedad de Pompe presentan un defecto en la inducción de células T reguladoras Foxp3+ (Tregs), y estas células tienen un menor potencial inhibidor en comparación con Tregs de ratones sanos. Alteraciones en el sistema inmunitario podrían contribuir a la fisiopatología de la enfermedad. Por lo tanto, estos hallazgos podrían abrir nuevos caminos para investigar estrategias que retrasen la progresión de la enfermedad. Además, las Tregs juegan un papel esencial en la terapia génica dirigida al hígado, mediante la inducción de tolerancia inmune hacia transgenes expresados por hepatocitos. Por lo tanto, futuros estudios deberán evaluar el impacto de las alteraciones inmunitarias asociadas a la enfermedad de Pompe sobre la eficacia de la terapia génica.

La malaltia de Pompe és una malaltia lisosomal (lysosomal storage disease, LSD) deguda a mutacions en l'enzim α-glucosidasa àcida (GAA), que hidrolitza el glicogen en glucosa als lisosomes. La disfunció d'aquest enzim causa l'acumulació de glicogen en múltiples teixits, principalment en cèl·lules musculars i neurones. Com a resultat, els pacients presenten hipertròfia cardíaca, debilitat muscular, insuficiència respiratòria, alteracions cognitives i mort prematura per aturada cardiorespiratòria. Actualment, la malaltia de Pompe és tractada amb teràpia de reemplaçament enzimàtic (Enzyme replacement therapy, ERT) amb GAA recombinant humana (rhGAA). Aquest tractament ha demostrat corregir la patologia cardíaca i estendre l'esperança de vida dels pacients. No obstant, l'eficàcia de l'ERT en els músculs respiratoris i esquelètics és parcial, i nul·la en el sistema nerviós central (SNC). A més, la proteïna rhGAA és altament immunogènica, de manera que el tractament no és efectiu en certs pacients. Altres inconvenients són l'elevat cost de l'ERT i la necessitat d'infusions continuades al llarg de la vida del pacient. En aquest estudi mostrem que la teràpia gènica dirigida al fetge mitjançant vectors adeno-associats (AAV) expressant una versió modificada de la GAA millora de forma significativa la malaltia a nivell de la musculatura esquelètica i del SNC, en un model animal de la malaltia de Pompe. A més, mostrem que aquest tractament és superior en eficàcia al tractament estàndard per ERT, fins i tot a dosis reduïdes de vector AAV. Per tal de comprendre millor els mecanismes d'acció d'aquests dos tractaments, hem dut a terme un estudi farmacocinètic dels nivells de GAA en circulació i en múltiples teixits en ambdós casos. Aquest estudi mostra que nivells reduïts però constants de GAA en circulació proporcionats pel fetge permeten una major acumulació de la GAA en els teixits en comparació a la ERT, millorant així l'eficàcia del tractament. Degut a que les reaccions immunes contra el vector AAV i el transgèn són un obstacle important en l'aplicació clínica de la teràpia gènica, i a que alteracions en els lisosomes han demostrat tenir un impacte sobre el sistema immune en differents models, també hem avaluat el sistema immune en el cas de la malaltia de Pompe. Mitjançant aquests estudis, hem observat que l'acumulació de glicogen en els lisosomes de les cèl·lules immunes està associada a una major activació d'aquestes cèl·lules en pacients i ratolins amb malaltia de Pompe, particularment en les cèl·lules T. A més, ratolins amb malaltia de Pompe presenten inflamació dels teixits ja en les primeres etapes de la malaltia. D’altra banda, hem observat que el major estat d'activació de les cèl·lules T podria ser degut a alteracions en el metabolisme d'aquestes cèl·lules, com a resultat de les alteracions lisosomals. Finalment, els ratolins amb malaltia de Pompe presenten un defecte en la inducció de cèl·lules T reguladores Foxp3+ (Tregs), i aquestes cèl·lules tenen un menor potencial inhibidor en comparació amb les Tregs de ratolins sans. Alteracions en el sistema immunitari podrien contribuir a la fisiopatologia de la malaltia. Per tant, aquestes observacions podrien obrir nous camins a l’hora d’investigar estratègies que retardin la progressió de la malaltia. A més, les Tregs juguen un paper essencial en la teràpia gènica dirigida al fetge, mitjançant la inducció de tolerància immune cap a transgens expressats per hepatòcits. Per tant, futurs estudis hauran d'avaluar l'impacte de les alteracions immunitàries associades a la malaltia de Pompe sobre l'eficàcia del tractament per teràpia gènica.