Étude structurale et fonctionnelle de l'appareil de recombinaison homologue chez Streptococcus pneumoniae

Structure and function of the homologous recombination apparatus in Streptococcus pneumoniae

• Auteur / Autrice : Thomas Perry
• Direction : Rémi Fronzes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance le 20/09/2019
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Groupe à 5 ans Biologie structurale de la sécrétion bactérienne (Paris ; 2009-....) - Institut européen de Chimie et de Biologie
• Jury : Président / Présidente : Guennadi Sezonov
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claudine Mayer, Olivera Francetic
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pablo Radicella, Jean-Baptiste Charbonnier

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN hélicase

Pneumocoque

Protéines recombinées

Transformation bactérienne

Mots clés libres

Streptococcus pneumoniae

Cryomicroscopie

Recombinaison homologue

Transformation bactérienne

Reconstruction hélicoïdale

Recombinase RecA

Relion

RMN

Homologous recombination

Transformation

Cryomicroscopy

Résumé

La transformation naturelle est la capacité de certaines bactéries à incorporer et à intégrer activement de l’ADN extra-cellulaire. Ce procédé majeur augmente la plasticité et l’adaptabilité des bactéries à Gram positif et négatif en réalisant des échanges génétiques intra- et inter-espèces. S. pneumoniae est un pathogène majeur de l’Homme et se retrouve de façon commensale dans les muqueuses du nasopharynx. Cette bactérie est responsable d’infections sévères telles que des pneumonies, des méningites et des septicémies. Dans cette espèce, la transformation naturelle est corrélée au phénomène de changement de capsule et à la baisse d’efficacité des vaccins, ainsi qu’à l’obtention de gènes de résistance aux antibiotiques. Au cours de la transformation, l’ADN extra-cellulaire va être pris en charge dans le cytoplasme par différentes protéines, qui permettront à terme d’intégrer ce gène au génome bactérien par recombinaison homologue. La recherche d’homologie et l’intégration du gène est sous le contrôle de la recombinase universelle RecA. Pour cela, RecA va former un filament hélicoïdal avec l’ADN sb exogène et db endogène, et ceux de manière ATP dépendante. Toutefois, la structure atomique de tels filaments n’a jamais été observé chez S. pneumoniae. Par des techniques de caractérisation biochimique et de cryo-microscopie électronique nous sommes parvenus à résoudre la structure des deux types de filaments à des résolutions de 3.8 Å et 3.9 Å. Ce qui nous a permis par la suite de mieux caractériser l’interaction de RecA avec l’ADN. En comparant nos structures avec celles obtenues par cristallographie des filaments de RecA observé chez E. coli, nous avons en partie expliqué les raisons de l’efficacité de recombinaison 3 fois supérieur de S. pneumoniae. Dans un second temps, nous avons mis en évidence in vitro un lien entre la filamentation de RecA le long de l’ADN et l’activité hélicase de RadA. RadA est une protéine nécessaire à la recombinaison homologue et dont l’activité hélicase semble promouvoir et étendre la D-loop au niveau de l’ADN db endogène. Nous avons également caractérisé, par RMN, la structure du motif en doigt de zinc de RadA et son interaction avec l’ADN, motif qui n’avait pu être résolu dans la structure de RadA en cristallographie et qui semble indispensable à son activité hélicase.

Natural transformation is the ability of some bacteria to incorporate and actively integrate extracellular DNA. This major process increases the plasticity and adaptability of gram positive and negative bacteria by performing intra- and inter-species genetic exchanges. S. pneumoniae is a major human pathogen and is found commensally in the mucous membranes of the nasopharynx. This bacterium is responsible for severe infections such as pneumonia, meningitis and sepsis. In this species, the natural transformation is correlated with the phenomenon of capsule change and the decrease of vaccine efficacy, as well as the obtaining of genes for antibiotic resistance. During the transformation, the extracellular DNA will be supported in the cytoplasm by different proteins, which will eventually integrate this gene into the bacterial genome by homologous recombination. The search for homology and the integration of the gene is under the control of the universal recombinase RecA. For this, RecA will form a helical filament with exogenous ssDNA and endogenous dsDNA, and those in ATP dependent manner. However, the atomic structure of such filaments has never been observed in S. pneumoniae. Using biochemical characterization techniques and electron cryomicroscopy, we succeeded in solving the structure of the two types of filaments at resolutions of 3.8 Å and 3.9 Å. This allowed us to better characterize the interaction of RecA with DNA. By comparing our structures with those obtained by crystallography of RecA filaments observed in E. coli, we partly explained the reasons for the 3-fold recombination efficiency of S. pneumoniae. In a second step, we demonstrated in vitro a link between the RecA filamentation along the DNA and the helicase activity of RadA. RadA is a protein necessary for homologous recombination and whose helicase activity seems to promote and extend D-loop at the level of endogenous dsDNA. We have also characterized, by NMR, the structure of the zinc finger motif of RadA and its interaction with DNA, a motif that could not be solved in the RadA structure in crystallography and which seems essential for its helicase activity.