Étude de la propagation prion-like de l'alpha-synucléine dans des réseaux de neurones reconstruits

par Josquin Courte

Thèse de doctorat en Neurosciences

Sous la direction de Jean-Michel Peyrin et de Catherine Villard.

Soutenue le 03-10-2019

à Sorbonne université , dans le cadre de École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris) , en partenariat avec Neurosciences Paris-Seine (laboratoire) et de Unité physico-chimie Curie (Paris) (laboratoire) .

Le président du jury était Marie-Claude Potier.

Le jury était composé de Carole Crozet, Christophe Cullin.

Les rapporteurs étaient Thierry Baron, Vincent Béringue.


  • Résumé

    Les maladies neurodégénératives (telles que les maladies de Parkinson et d’Alzheimer) sont caractérisées par l’agrégation de protéines mal repliées en dépôts insolubles. Ces dépôts engendrent des dysfonctions cellulaires, et semblent donc avoir un rôle fondamental dans le développement de ces pathologies. L’apparition de ces dépôts se fait de façon stéréotypée dans des sous-groupes de patients. Notamment, dans la maladie de Parkinson, la petite protéine présynaptique alpha-synucléine (aSyn) est le composant principal d’agrégats dénommés corps de Lewy et neurites de Lewy. Les corps et neurites de Lewy apparaissent suivant un patron dénommé « staging de Braak » dans une sous-partie conséquente des patients. Dans une certaine mesure, le patron d’apparition des agrégats semblent suivre la connectivité neuro-anatomique entre les régions cérébrales, ce qui suggère que l’agrégation puisse se propager dans les réseaux neuronaux.L’étude des maladies prions telles que le kuru ou la maladie de Creutzfeldt-Jakob a mis en évidence un mécanisme original de propagation du mérepliement des protéines. La protéine PrP s’agrégeant dans ces pathologies est en effet capable d’adopter au moins deux conformations radicalement distinctes. L’une, pathologique, forme des agrégats, tandis que la forme fonctionnelle ne s’agrège pas. Par des mécanismes encore mal compris, mais qui potentiellement similaires à la formation de fibres amyloïdes, la protéine pathologique est en mesure de convertir la protéine fonctionnelle en sa forme anormale, et à l’inclure dans des agrégats. La forme anormale de la protéine est donc capable de s’auto-propager, et cela de cellule à cellule et d’organisme à organisme. De nombreuses similitudes dans les caractéristiques biochimiques et moléculaires des agrégats présents dans les maladies neurodégénératives non prions ont mené à l’hypothèse que l’agrégation protéique se fait suivant des modalités similaires aux maladies à prions. Suivant ce scénario, l’agrégation protéique est en mesure de se propager de neurone à neurone dans le cerveau via les connexions neuronales, et ainsi suivre un patron stéréotypé dépendant de l’interconnexion des régions successivement touchées. Cette hypothèse est dénommée « prion-like ».Cependant, les mécanismes expliquant la génération d’un patron stéréotypé de développement prion-like des agrégats d’aSyn restent obscurs. Le but de ma thèse a été d’aborder les déterminants de la propagation de l’agrégation de l’aSyn dans des réseaux de neurones hétérogènes grâce à des modèles in vitro. J’ai tout d’abord évalué si différentes régions du cerveau de souris mises en culture primaire présentaient la même vulnérabilité au recrutement de l’aSyn soluble dans des agrégats pathologiques introduits dans le milieu extracellulaire. J’ai pu mettre en évidence que la vulnérabilité de neurones striataux, corticaux et hippocampaux était fortement différente, et que le facteur déterminant cette vulnérabilité était le niveau d’expression endogène de l’aSyn. J’ai ensuite développé un système de culture permettant la reconstruction contrôlée de réseaux de neurones binaires in vitro, composés de neurones primaires murins, dont les connexions sont parfaitement orientées d’un compartiment vers l’autre, un prérequis pour l’étude de la propagation d’un agent pathogène auto-propagatif. Un tel système est parfaitement original, et n’avait jamais été publié auparavant. J’ai finalement modélisé la propagation prion-like de l’aSyn dans de tels réseaux, en y introduisant des agrégats exogènes d’aSyn fluorescents dans le compartiment « présynaptique » et en évaluant la propagation de l’agrégation au compartiment « postsynaptique ». Ce transfert ne peut se faire que via les connexions neuronales poussant depuis le compartiment présynaptique, les deux compartiments étant fluidiquement isolés. [...]

  • Titre traduit

    Prion-like propagation of alpha-synuclein in reconstructed neural networks


  • Résumé

    Neurodegenerative diseases such as Parkinsons’s or Alzheimer’s diseases are characterized by the aggregation of misfolded proteins in insoluble inclusions. These inclusions trigger cellular dysfnctions and are therefore thought to play an important role in the development of these pathologies. They appear following a conserved pattern in subgroups of patients. In Parkinson’s disease, the small presynaptic protein alpha-synuclein (aSyn) is the main component of protein deposits termed Lewy bodies and Lewy neurites. These appear following a stereotypical pattern known as “Braak staging” in a consequent subset of patients. The pattern of inclusion formation partly follows neuroanatomical connectivity, suggesting that protein aggregation propagates in neural networks. Prion diseases such as kuru or Creutzfeldt-Jakob’s disease have revealed an original mechanism for propagating protein misfolding. The PrP protein, aggregated in these diseases, is able to have two radically distinct conformations. The pathological one aggregates in supramolecular assemblies, while the functional one does not. Through an incompletely understood mechanism which might share similarities with the formation of amyloid fibrils, the pathological form of the protein is able to convert the functional form into the pathological one, recruiting it into aggregates. The abnormal form of the protein is thus able to self-propagate, from cell to cell and from organism to organism. Numerous biochemical and molecular characteristics of aggregates detected in neurodegenerative diseases are shared with the prion aggregates. It is thus hypothesized that protein aggregation in neurodegenerative diseases unfolds in a similar manner to prion aggregation. In this scenario, protein aggregation is able to be transmitted from neuron to neuron following neuroanatomical connectivity, and thus propagates in a stereotypical manner in neural networks following axonal tracts. This scenario is named “prion-like hypothesis”. However, how the prion-like propagation of aSyn generates the conserved pattern of aggregates in the brain of patients is still unknown. The aim of my PhD thesis has been to decipher parameters impacting the prion-like propagation of aSyn in heterogeneous neural networks with in vitro models. I first assessed if specific neuronal populations cultured from various regions of the mouse brain exhibited the same vulnerability to the prion-like recruitment of aSyn in pathological aggregates following their exposure to exogenous aSyn fibrils. I was able to demonstrate that cortical, striatal and hippocampal primary neuronal cultures had a significant difference in their vulnerability to prion-like seeding of aSyn aggregation. I also demonstrated that this vulnerability was due to the differential expression of aSyn in these populations. I then developed a culture system allowing for the controlled reconstruction of primary murine neurons networks. This system allows for the perfect filtration of axonal outgrowth in one direction, thus allowing the reconstruction of fully oriented binary networks. Axonal growth orientation is a prerequisite to the in vitro study of pathogens propagation in neural networks. This system is the first to achieve this level of axonal filtration while allowing synaptic connectivity between the two compartments. I finally modeled aSyn prion-like propagation in these reconstructed networks by selectively introducing exogenous fluorescent aSyn fibrils in the “presynaptic” compartment and following aggregation propagation to the “postsynaptic” compartment. This propagation can only occur through crossing axons, as the two compartments are fluidically isolated. I demonstrated that anterograde aSyn prion-like propagation was relatively inefficient in this experimental framework. Indeed, while a small quantity of exogenous fibrils are transferred to postsynaptic neurons, they are not able to seed endogenous aSyn aggregation in those. [...]

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