Microfluidique pour la mesure de bio-molecules secretees

Microfluidics for measuring secreted biomolecules

• Auteur / Autrice : Adrien Saint-Sardos
• Direction : Charles Baroud, Gabriel Amselem
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 04/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interfaces : matériaux, systèmes, usages (Palaiseau, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École polytechnique (Palaiseau, Essonne ; 1795-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'Hydrodynamique de l'École polytechnique (Palaiseau ; 1990-....)
• Jury : Président / Présidente : Myriam Taverna
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Charles Baroud, Gabriel Amselem, Jean-Christophe Baret, Clément Nizak, Yves Fouillet, Séverine Legac
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-Christophe Baret, Clément Nizak

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biotechnologie

ELISA

Microfluidique

Biomolécules actives

Mécanique des fluides

Mots clés libres

Microfluidique

Culture cellulaire 3D

Cytokine

Sécrétome

Variabilité

ELISA

Microfluidics

3D cell culture

Cytokine

Secretomics

Variability

ELISA

Résumé

Cette thèse porte sur l’étude et la quantification des molécules sécrétées par des cellules mammifères, organisées sous forme de sphéroïdes 3D dans des gouttes microfluidiques.Le sécrétome joue un rôle prépondérant dans la régulation des communications entre cellules eucaryotes, et contribue à la réponse collective des cellules de l’organisme. Caractériser la diversité des protéines sécrétées par des populations de cellules est ainsi une clé pour relier leur phénotype à leurs fonctions sécrétoires. Au cours des deux dernières décennies, des solutions technologiques ont ainsi permis de quantifier séparément le sécrétome de cellules non-adhérentes individuelles. Ces technologies, qui ouvrent la voie vers des mesures multiplexées de plusieurs molécules sécrétées par un très grand nombre de cellules, sont cependant difficiles à transposer dans le cas de cellules ayant besoin d’un substrat physique pour survivre.Dans ce manuscrit, on commence donc par présenter la plateforme microfluidique utilisée au cours de la thèse pour la culture de cellules adhérentes sous forme d’agrégats 3D particuliers, appelés sphéroïdes. Dans cette plateforme, nous développons un premier test immunologique type ELISA pour la quantification de la cytokine inflammatoire IL-1β, en utilisant des billes fonctionnalisées par des anticorps spécifiques à cette cytokine. L’utilisation combinée de la microscopie de fluorescence et de l’analyse informatisée des images permet de relier un signal optique lié au test immunologique à une grandeur biologique, ici la concentration de cytokine. Dans une goutte de 400µm, la vitesse de diffusion des molécules concurrence la cinétique chimique du test immunologique : une part importante de la réflexion se voit donc dédiée à l’étude, expérimentale et théorique, de la capture des cytokines sur le substrat du test ELISA en goutte.On applique ce test immunologique à la sécrétion de sphéroïdes de cellules souches mésenchymateuses humaines hMSC. Ces cellules constituent une population hétérogène progénitrice de plusieurs types cellulaires, et démontrent une action trophique importante lorsqu’elles sont cultivées en 3D. Dans la plateforme microfluidique présentée, on mesure ainsi des sécrétions importantes d’IL-1β, mais aussi de la molécule-signal de l’angiogenèse VEGF. Un modèle numérique de réaction-diffusion permet de prédire les temps caractéristiques de capture par le test immunologique. En plus de mettre en évidence l’accumulation des molécules dans le temps, ce test révèle les effets d’un médicament non-stéroïdien sur la sécrétion de VEGF. Ces effets sur le sécrétome sont combinés à l’observation de la morphologie du sphéroïde, et à la mesure de sa production intracellulaire de VEGF.Les signaux associés à la production intra et extra-cellulaire présentent une large variabilité au sein d’un même répliqua biologique. Le dernier chapitre relie ces variabilités à celles de la population de cellules qui constituent nos sphéroïdes. Il semble exister un effet collectif à l’intérieur de l’agrégat qui dépasse la simple sommation des hétérogénéités cellulaires.

This thesis presents some results about sécrétome quantification by 3D-organized mammalian cells. Secretome has a key role in cell-to-cell interactions, and ultimately contributes to collective cellular response. The characterization of individual diversity within a population for protein secretion is therefore required to better understanding the link between cellular phenotype and secretory functions. Researches of the last two decades have led to multiplexed and high-throughput methods for quantifying cellular secretion of anchorage-independent cells. But these methods are difficult to transpose to cells needing a physical substrate to adhere on. In this manuscript is presented a microfluidic platform that allows the culture of anchorage-dependent cells as a dense array of spheroids. In this platform, we developed an immuno-assay to quantify the presence of the cytokines IL-1β, based on antibody-grafted beads. Using fluorescence microscopy and image analysis, an optical signal read on micrometric beads is translated to a biological information on cytokine concentration. As diffusion times compete with reaction kinetics within our device, a theoretical study of cytokine transport and capture inside the droplet is developed.This immune-assay is tested on human mesenchymal stem cells spheroids. hMSCs constitute a cell population of progenitors of several cellular types of connective tissues and display important trophic functions while cultivated in 3D. In our microfluidic device, we demonstrated important secretions of IL-1β, but also of the angiogenesis chemokine VEGF. A numerical model of reaction-diffusion allows to predict characteristic times of cytokine capture by the immune-assay. In addition of evidencing VEGF accumulation over time, the assay unravels the effect of a non-steroidal drug on VEGF secretion.Signals associated with intra and extracellular production of VEGF by spheroids show a wide variability within a single biological replicate. The last chapter is therefore trying this variability with heterogeneities at the cell level, as there seems to be a collective effect within spheroids that goes beyond the simple summation of cellular features.