Etude de l'hémostase et de l'endothélium dans les déficits héréditaires de la glycosylation des protéines (CDG)

Study of hemostasis and endothelium in congenital disorder of glycosylation (CDG)

• Auteur / Autrice : Tiffany Pascreau
• Direction : Delphine Borgel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie, physiopathologie
• Date : Soutenance le 20/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hémostase, inflammation, thrombose (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Pascale de Lonlay
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Delphine Borgel, Pascale de Lonlay, François Foulquier, Véronique Regnault, Marc Vasse
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : François Foulquier, Véronique Regnault

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hémostase

Glycosylation

Endothélium

Mots clés libres

Endothélium

Cdg

Glycosylation

Test de génération de thrombine

Cdg

Thrombin generation assay

Endothelium

Glycosylation

Résumé

L’objectif de ce travail de thèse était d’évaluer le rôle des N-glycosylations sur l’hémostase, à la fois sur les protéines de la coagulation et sur l’endothélium. Le rôle des chaînes glycanes des protéines de l’hémostase a été principalement étudié à l’aide des méthodes de déglycosylation enzymatique et de mutagenèse dirigée. Afin d’étudier le rôle des chaînes glycanes sur l’hémostase dans un système global, nous nous sommes intéressés aux déficits héréditaires de glycosylation (CDG). Les patients atteints de CDG présentent fréquemment des anomalies de l’hémostase principalement caractérisées par des déficits en facteurs de la coagulation et en inhibiteurs physiologiques. Ces anomalies de l’hémostase s’accompagnent de complications neurologiques aigues appelées stroke-like (SL) dont le mécanisme physiopathologique n’est pas complètement élucidé. Afin d’évaluer de façon globale l’impact de l’ensemble des anomalies rencontrées chez les patients sur la coagulation nous avons choisi d’utiliser le test de génération de thrombine (TGT) en absence et en présence de thrombomoduline soluble (TMs) de manière à mobiliser le système de la protéine C (PC). Sur notre série de 35 patients atteints de CDG, les déficits en antithrombin et facteur XI sont les plus fréquents (71% et 57% des patients respectivement), suivi des déficits en PC et protéine S (29% et 26% respectivement). Seulement 11% des patients présentent un déficit en FIX. En l’absence de TMs, le TGT révèle un profil hypercoagulant. Après addition de TMs on observe une résistance à la mobilisation du système de la PC, ce qui renforce l’hypercoagulabilité observé sans TMs. Afin d’étudier les propriétés de l’endothélium affecté par un défaut de glycosylation, nous avons également développé un modèle cellulaire inactivé pour PMM2 à partir d’une lignée endothéliale cérébrale hCMEC/D3. L’endothélium est doté de propriétés anticoagulantes en exprimant entre autres les récepteurs impliqués dans l’activation de la PC, la TM et l’endothelial protein C receptor (EPCR). Nous avons montré que les cellules inactivées pour PMM2 présentent un défaut d’activation de la PC dû à une diminution des transcrits des gènes codant pour la TM et l’EPCR et donc une diminution de l’expression de la TM et de l’EPCR concourant à une perte du potentiel anticoagulant de l’endothélium. Par ailleurs nous avons mis en évidence une hyperperméabilité de la barrière endothéliale à l’état basale en partie expliquée par la perte d’intégrité des jonctions adhérentes. De plus, nous avons montré que la barrière formée par les cellules inactivées pour PMM2 est plus sensible à un stimulus déstabilisateur comme la thrombine. En revanche les effets cytoprotecteurs de la protéine C activée (PCA) sont conservés. La dysfonction endothéliale ainsi mise en évidence pourrait jouer un rôle dans le développement de l’hyperperméabilité rencontrée dans les épisodes de SL. De plus, malgré l’absence de mise en évidence de thrombus au cours des SL, l’hypothèse de la formation de micro-thrombi et d’ischémie transitoire favorisés par les anomalies de la coagulation observées chez les patients atteints de CDG ne peut être exclue.

The aim of this study was to evaluate the role of N-glycosylations on hemostasis, both on coagulation proteins and on the endothelium. In order to study the role of glycan chains on hemostasis in a global system, we were interested in congenital disorder of glycosylation (CDG). Patients with CDG have hemostasis abnormalities mainly characterized by deficiencies in coagulation factors and physiological inhibitors. These abnormalities are accompanied by acute neurological complications called stroke-like (SL) whose pathophysiological mechanism is not fully understood. In order to assess the overall impact of all the abnormalities encountered in patients on coagulation, we used the thrombin generation assay (TGA) with or without soluble thrombomodulin (sTM) in order to mobilize the protein C (PC) system. In our series of 35 patients with CDG, antithrombin and factor XI deficits are the most frequent (71% and 57% of patients respectively), followed by PC and protein S deficits (29% and 26% respectively). Only 11% of patients have a FIX deficiency. In the absence of sTM, the TGA revealed an hypercoagulant profile. After addition of sTM, resistance to the mobilization of the PC system was observed, which reinforced the hypercoagulability state observed without sTM. In order to study the properties of endothelium affected by glycosylation defect, we developed a PMM2 knock-down (KD) endothelial model hCMEC/D3. The endothelium has anticoagulant properties by expressing, the receptors involved in PC activation, TM and endothelial protein C receptor (EPCR). We have shown that PMM2 KD cells have a lack of PC activation due to a decrease in transcripts of genes encoding TM and EPCR and thus a decrease in TM and EPCR expression contributing to a loss of endothelium anticoagulant potential. In addition, we have demonstrated a hyperpermeability of the endothelial barrier in the basal state, partly explained by the loss of integrity of the adherent junctions. In addition, we have shown that the barrier formed by PMM2 KD cells is more sensitive to a destabilizing stimulus such as thrombin. On the other hand, the cytoprotective effects of activated protein C (APC) are maintained. The endothelial dysfunction that we have highlighted could play a role in the development of hyperpermeability encountered in SL episodes. In addition, despite the absence of evidence of thrombus during SL, the hypothesis of the formation of microthrombi and transient ischemia favoured by coagulation abnormalities observed in patients with CDG cannot be excluded.