Etude d'interactions protéine-ADN : Interactions Ku70/Ku80-ADN au sein de la voie NHEJ et caractérisation d'inhibiteurs d'une interaction protéine-ADN cible dans un contexte de recherche de médicaments

Protein-DNA interaction study : Ku70/Ku80-DNA interactions in the NHEJ pathway and characterization of inhibitors of a target protein-DNA interaction in a drug search context

• Auteur / Autrice : Amandine Gontier
• Direction : Jean-Baptiste Charbonnier, Alexey Rak
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 06/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Nessler
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Baptiste Charbonnier, Alexey Rak, Sylvie Nessler, Ludovic Sauguet, Éric Ennifar, Mireille Bétermier, Bertrand Raynal
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ludovic Sauguet, Éric Ennifar

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions ADN-protéine

ADN -- Réparation

Mots clés libres

SwitchSENSE

Biophysique

Ku70/80

Caractérisation de médicaments

Cristallographie

Nhej

SwitchSENSE

Nhej

Ku70/80

Drugs characterization

Biophysics

Crystallography

Résumé

Pour qu’un organisme soit viable, il est essentiel que la molécule d’ADN soit dupliquée et transmise aux générations filles dans son intégralité avec le moins d’altérations possibles. Des cassures double-brin (CDB) peuvent apparaitre suite à des stress endogènes ou exogènes et constituent les dommages de l’ADN les plus toxiques. La radiothérapie a pour but générer de manière localisée des CDBs dans les cellules tumorales et de déclencher leur apoptose. Un enjeu majeur actuel est de comprendre le mécanisme de résistance de certaines tumeurs à ces CDBs et de caractériser de nouveaux inhibiteurs du NHEJ pour potentialiser l’effet de la radiothérapie. La voie NHEJ débute par la reconnaissance des deux extrémités de l’ADN d’une CDB par une protéine hétérodimérique Ku70/80 (Ku). Celle-ci sert de plateforme de recrutement aux autres facteurs de la voie NHEJ impliqués dans la maturation (processing) et la ligation des extrémités de l’ADN. Le premier volet de cette thèse a porté sur la caractérisation de sites d’interactions protéine-protéine de Ku et sur la caractérisation de nouvelles molécules comme médicaments potentiels dirigés contre Ku. Les sites d’interactions de deux partenaires majeurs de Ku, XLF et APLF, ont été caractérisés par calorimétrie en utilisant des peptides contenant le motif d’interaction de ces protéines appelés KBM (pour Ku-Binding Motifs) ou les protéines elles-mêmes. La structure cristallographique d’un complexe Ku-ADN avec une petite molécule, l’IP6, a été résolue. L’IP6 présente une forte affinité pour Ku avec un KD de 50 nM. Nous avons montré que cette molécule stimule la fixation de Ku sur l’ADN par trois méthodes biophysiques (calorimétrie, switchSENSE et sm-TIRF). Enfin, un criblage haut débit d’une chimiothèque de 987 molécules fragments de Sanofi a été réalisé in vitro par DSF et validé par RMN sur la protéine Ku. Ce crible a permis d’identifier 15 fragments susceptibles d’interagir avec Ku. Ces travaux ouvrent la voie pour la conception rationnelle d’inhibiteurs dérivés des peptides pXLF, pAPLF, de la molécules IP6 ou des fragments identifiés par le crible en greffant sur ces plateformes de nouvelles fonctions chimiques pour améliorer encore l’affinité et bloquer la voie NHEJ. Le second volet de cette thèse a porté sur des interactions de type protéine-ADN étudiées par Sanofi dans un projet de découverte de nouvelles drogues en oncologie et l’analyse de la valeur ajoutée d’une nouvelle approche le switchSENSE implémentée au CEA de Saclay. Nous avons analysé 4 constructions d’une protéine interagissant avec deux ADN et l’effet de 15 molécules inhibitrices identifiées en amont dans le service « Integrated Drug Discovery » de Sanofi. Les expériences de switchSENSE ont permis de caractériser les KD des 4 constructions pour l’ADN et de mesurer des constantes d’inhibition pour les inhibiteurs. Ces mesures sont en bon accord avec les mesures effectuées à Sanofi par SPR, MST et RMN et permettent de positionner le switchSENSE comme une approche prometteuse dans la validation de nouveaux inhibiteurs en particulier pour les interactions protéine-ADN.

The maintenance of DNA integrity is central in all organisms to ensure successful life and reproduction.The DNA should be duplicated and transmitted to next generation cells in its entirety with a minimalamount of alteration. Double-strand breaks (DSBs) are the most toxic DNA damages and can originatefrom endogenous or exogenous stresses . In antic-cancer treatments, radiotherapy aims at generatingDSBs locally on tumor cells and thus induce their apoptosis. Current major challenge nowadays is tounderstand the mechanism of resistance of some tumors to these treatments and to characterize newinhibitors of NHEJ to potentiate the effect of radiotherapy. The NHEJ pathway begins with therecognition of CDBs extremities by a Ku70/80 (Ku) heterodimeric protein. Ku serves as a recruitmentplatform for the other factors of the NHEJ pathway involved in the processing and ligation of the DNAends. The first part of this thesis focuses on the characterization of Ku-protein interaction sites and onthe characterization of new molecules as potential drugs against Ku. The interaction sites of two majorKu partners, XLF and APLF, were characterized by calorimetry using peptides containing theinteraction motif of these proteins, called KBM (for Ku-Binding Motifs) or the proteins themselves. Thecrystallographic structure of a Ku-DNA complex with a small molecule, IP6, has been determined. TheIP6 has a strong affinity for Ku with a KD of 50 nM. We showed that this molecule stimulates Ku bindingon DNA by three biophysical methods (calorimetry, switchSENSE and sm-TIRF). Finally, a highthroughput screening of library of Sanofi fragments of 987 molecules was performed in vitro by DSFand validated by NMR on the Ku protein and identified 15 fragments that could interact with Ku. Thiswork paves the way for the rational design of inhibitors derived from the pXLF peptides, pAPLF, IP6molecules or fragments by grafting on these platforms new chemical functions to further improve theaffinity and inhibit the NHEJ pathway. The second part of this thesis focused on protein-DNAinteractions studied by Sanofi in a discovery drugs project in oncology and the analysis of the addedvalue of a new approach switchSENSE implemented at CEA Saclay. We analyzed 4 constructs of aprotein interacting with two DNAs and the effect of 15 inhibitory molecules identified upstream inSanofi's « Integrated Drug Discovery » service. The switchSENSE experiments made it possible tocharacterize the KD of the 4 constructs for DNA and to measure inhibition constants for the inhibitors.These measurements are in good agreement with the measurements made at Sanofi by SPR, MST andNMR. This study positions the switchSENSE as a promising approach in the validation of newinhibitors, in particular for protein-DNA interactions.