Development of a Targeted Therapy for Charcot Marie Tooth 1A (CMT1A) Neuropathy Based on siRNA PMP22 Squalene Nanoparticles

par Suzan Boutary

Thèse de doctorat en Recherche clinique, innovation technologique, santé publique

Sous la direction de Liliane Massade.

Le président du jury était Elias Fattal.

Le jury était composé de Liliane Massade, Elias Fattal, Frédéric Charbonnier, Ruth Stassart, Charbel Massaad, Didier Desmaële.

Les rapporteurs étaient Frédéric Charbonnier, Ruth Stassart.

  • Titre traduit

    Développement d’une thérapie ciblée pour la maladie Charcot Marie Tooth 1A (CMT1A) par des nanoparticules siRNA PMP22 squalénées


  • Résumé

    La maladie de Charcot Marie Tooth 1A (CMT1A) est la neuropathie héréditaire la plus fréquente au monde. Elle est due à la duplication du gène PMP22. A ce jour, la majorité des traitements testés sont plus palliatifs que curatifs. L’objectif de ce projet est de développer un nouveau traitement pour CMT1A basé sur la normalisation de la surexpression du gène PMP22 par une thérapie ciblée par siRNA. Dans cet objectif, huit siRNA PMP22 ont été conçus et testés dans la lignée cellulaire MSC-80. In vitro, le siPM22 n°7 a montré une inhibition de 50% du gène de PMP22 et de l’expression de la protéine correspondante sans affecter la viabilité cellulaire. Cet siRNA a été choisi pour les études ultérieures. Afin de protéger le siRNA PMP22 de la dégradation enzymatique et d’améliorer son internalisation cellulaire, nous l’avons couplé à un précurseur du cholestérol, le squalène (SQ), qui a la particularité de former des nanoparticules (NP) dans l’eau. Après bioconjugaison, obtention et caractérisation des NPs siRNA PMP22-SQ nous montrons que leur caractère lipophile reste stable au cours du temps et qu’ils restaient biologiquement actif. In vitro, dans les cellules MSC80, les NPs siRNA PMP22-SQ inhibent, tout comme le siRNA PMP22 transfecté l’expression du gène de PMP22 à 50%. In vivo, les NPs siRNA PMP22-SQ injectées par i.v. resituent l’activité motrice ainsi que la vitesse de conduction nerveuse et le potentiel d’action musculaire, dans deux modèles de souris transgéniques de CMT1A, portant une copie supplémentaire (JP18 B6) ou deux copies supplémentaires (JP18/Y13 B6) de PMP22. Après sacrifice des souris, nous montrons par microscopie confocale que les 2 facteurs de transcription KROX20 et SOX10 ainsi que les neurofilaments sont augmentés dans les coupes de nerfs sciatiques traités par les NPs siRNA PMP22-SQ témoignant d’une myélinisation et une régénération axonale. En microscopie électronique, nous observons une normalisation du phénotype qui se traduit par une compaction de la myéline après internalisation des NPs siRNA PMP22-SQ dans les cellules de Schwann ainsi que dans les axones. En conclusion, nous montrons qu’un traitement ciblé par des NPs siRNA PMP22 normalisant l’expression de la PMP22 pourrait faire l’objet d’une future thérapie de la maladie CMT1A. Des études précliniques toxicologiques seront effectuées pour confirmer leur utilisation clinique.Ce travail est soutenu par un financement publique supervisé par l’agence national de recherche (ANR) dans le cadre du programme de «investissement d’avenir » : Labex NanoSaclay, reference: ANR-10-LABX-0035 et, protégé par un brevet international No. PCT/EP2019/075736: ANTISENSE RNA TARGETINGPMP22 FOR THE TREATMENT OF CHARCOT-MARIE-TOOTH 1A DISEASE. MASSADE Liliane, MASSAAD Charbel, BOUTARY Susan, URBINATI Giorgia Maria Laura, COUVREUR Patrick, DESMAËLE Didier


  • Résumé

    Charcot Marie Tooth disease 1A (CMT1A) is the most common inherited neuropathy worldwide. It is due to a duplication in the PMP22 gene. Up to date, most of the tested drugs are rather symptomatic and not effective in reversing CMT neuropathy scores. Hence, the goal of this project is to develop new treatment for CMT1A using a targeted therapy against PMP22 by siRNA. Eight siRNA PMP22 were designed and tested on mouse Schwann cells. In vitro, siPM22#7 showed 50% inhibition of PMP22 gene and protein expression and did not affect cell viability therefore, it was chosen for further studies. To protect this siRNA from degradation and improve its internalization, we used a precursor of cholesterol, squalene (SQ), that have the particularity to give nanoparticles (NPs) in water. After bioconjugation and characterization of the resulting siPMP22-SQ NPs we depicted that their lipophilic characteristic remained stable with time, and most importantly, still biologically active. In vitro they were able to inhibit PMP22 gene expression of about 50 % similar to naked transfected siPMP22. In two CMT1A transgenic mice models carrying one extra copy (JP18 B6) or 2 extra copies (JP18/JY13 B6) of PMP22, we showed that siPMP22-SQ NPs normalized the motor activity. Moreover, nerve conduction velocity and compound muscle action potential revealed improvement in the siPMP22-SQ NPs treatment group in both mice models. Histologically, the effect of the siPMP22-SQ NPs was clear in electron microscopy images that displayed a proper alignment of myelin around the axon. In addition, KROX 20, SOX10 and neurofilament levels were normalized thus indicating that myelin and axonal regeneration can take place in the groups treated with siPMP22-SQ NPs. Interestingly, we found that siRNA-SQ NPs reached Schwann cells and axons. To conclude, a treatment using siRNA against PMP22 can be the future therapy for CMT1A once it proved its safety and tolerability.This work is supported by a public grant overseen by the French National Research Agency (ANR) as part of the “Investissements d’Avenir” program (Labex NanoSaclay, reference: ANR-10-LABX-0035) and protected by an international patent No. PCT/EP2019/075736: ANTISENSE RNA TARGETINGPMP22 FOR THE TREATMENT OF CHARCOT-MARIE-TOOTH 1A DISEASE. MASSADE Liliane, MASSAAD Charbel, BOUTARY Susan, URBINATI Giorgia Maria Laura, COUVREUR Patrick, DESMAËLE Didier



Le texte intégral de cette thèse sera accessible librement à partir du 31-12-2022

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