Etude structurale et fonctionnelle de la glycoprotéine des Rhabdovirus

Structural and functional study of the Rhabdovirus glycoprotein

• Auteur / Autrice : Laura Belot
• Direction : Yves Gaudin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 16/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Minard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yves Gaudin, Philippe Minard, Denis Gerlier, Pierre-Yves Lozach, Marie-Christine Vaney
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Denis Gerlier, Pierre-Yves Lozach

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus de la stomatite vésiculeuse

Récepteur des lipoprotéines de basse densité

Virus Mokola

Microscopie électronique

Virus rabique

Vesiculovirus

Lyssavirus

Interactions protéine-protéine

Radiocristallographie

Fusion membranaire

Virologie moléculaire

Mots clés libres

Rhabdovirus

Glycoprotéine

Récepteurs viraux

Anticorps neutralisants

Structures cristallographiques

Rhabdovirus

Glycoprotein

Viral receptors

Neutralizing antibody

Crystallographic structures

Résumé

Les Rhabdovirus sont des virus enveloppés à ARN simple brin de polarité négative. Ils possèdent une unique protéine transmembranaire à leur surface, la glycoprotéine G. G est impliquée dans les étapes précoces du cycle viral. G lie dans un premier temps un récepteur cellulaire, menant à l’endocytose du virus. Ensuite, G orchestre la fusion membranaire entre les membranes virale et endosomale. Cette fusion membranaire permet la libération du génome viral dans le cytoplasme de la cellule infectée.Le récepteur des lipoprotéines de basse densité (LDLR) est le récepteur principal du VSV. L’ectodomaine du LDLR est composé d’un grand site de liaison au ligand constitué de domaines riches en cystéines (CR1 à CR7).Afin de comprendre les bases moléculaires de l’interaction entre G et son récepteur, nous avons réalisé des tests de fixation de G aux différents domaines CR du LDLR. Cela a révélé que seuls les domaines CR2 et CR3 pouvaient lier G. Lorsque CR2 et CR3 sont incubés avec VSV dans l’inoculum, ils protègent les cellules de l’infection par VSV. Nous avons cristallisé G en complexe avec chacun de ces domaines CR. Les structures révèlent que le site de liaison de CR2 et de CR3 sur G sont identiques, et que les mêmes résidus sur G sont impliqués dans la liaison des deux domaines CR. Des cellules HAP-1 dans lesquelles le gène codant pour le LDLR a été invalidé, sont toujours sensibles à l’infection par VSV. Ceci confirme que VSV peut utiliser d’autres récepteurs que le LDLR pour entrer dans les cellules. Cependant la mutation des résidus de G qui sont clefs dans l’interaction avec les domaines CR du LDLR abolissent l’infectiosité de VSV aussi bien dans les cellules de mammifères que dans les cellules d’insectes. Ceci indique que les seuls récepteurs de VSV dans ces cellules sont des membres de la famille du LDLR et que VSV G a spécifiquement évolué pour interagir avec leur domaines CR. Par ailleurs nous avons montré que les G dont les résidus clef pour l’interaction avec les domaines CR sont mutés, ont conservé leur activité de fusion. Ces travaux montrent que les activités de reconnaissance du récepteur et de fusion de G peuvent être découplées. Ceci ouvre la possibilité de développer des glycoprotéines dérivées de G au tropisme modifié.Chez les Rhabdovirus, G est la seule cible des anticorps neutralisants. A ce jour il n’existe aucune structure de G de Rhabdovirus en complexe avec un anticorps. L’anticorps 8G5F11 neutralise plusieurs génotypes du genre Vésiculovirus dont VSV. Nous avons montré que les FAB 8G5F11 empêchent l’infection des cellules par VSV Indiana d’une part et qu’ils reconnaissent la forme pré- et post-fusion de VSV G avec une stœchiométrie G : FAB de 1 : 1 d’autre part. Nous avons mis au point les conditions d’observation du complexe G-FAB en cryo-microscopie électronique, ce qui permet d’envisager à terme une résolution de la structure du complexe G-FAB.Enfin, nous avons débuté une étude visant à caractériser les glycoprotéines d’autres Rhabdovirus du genre Lyssavirus. Pour cela, nous avons produit et purifié les ectodomaines de G du virus de la rage (RABV), du virus Mokola (MOKV) et du virus de la chauve-souris ouest-caucasienne (WCBV). Ces G ont été caractérisées par microscopie électronique à différents pH. Les mesures effectuées sur G à pH 8 sont compatibles avec celles attendues pour un monomère de G pré-fusion. A pH 6, les ectodomaines observés pourraient correspondre à un intermédiaire monomérique allongé apparaissant tardivement lors de la transition structurale. Ces résultats pourraient être prochainement validés par l’obtention de la structure cristallographique de l’ectodomaine de G MOKV.

Rhabdoviruses are single stranded RNA enveloped viruses. They own a unique glycoprotein G anchored on the viral membrane. G is involved in the early stages of the viral cycle. At first G binds a cellular receptor, leading to the virus endocytosis. Then G orchestrates the membrane fusion between the viral and endosomal membranes. Membrane fusion allows the release of the viral genome into the cytoplasm of the infected cell.The low-density lipoprotein receptor (LDLR) is the main receptor of VSV. The ectodomain of the LDLR is composed of a large ligand binding domain constituted of cysteine-rich domains (CR1 to CR7).In order to understand the molecular basis of the interaction between G and its receptor, we performed binding test of G with all the CR domains of the LDLR. This revealed that only CR2 and CR3 domains could bind G. When CR2 and CR3 are present in the VSV inoculum, they protect the cells from VSV infection. We crystallized G in complex with each of these CR domains. The structures reveal that CR2 and CR3 binding sites on G are identical, and that the same residues on G are involved in the binding of the two CR domains. HAP-1 cells in which the gene encoding the LDLR has been invalidated are still susceptible to VSV infection. This confirms that VSV can use other receptors than the LDLR itself to enter the cells. However, mutation of G residues that are key in the interaction with the CR domains of the LDLR abolish the infectivity of VSV in mammalian and insect cells. This indicates that the only VSV receptors in these cells are members of the LDLR family and that VSV G has specifically evolved to interact with their CR domains. Moreover, we have shown that G mutated for key residues involved in the interaction with CR domains, are still able to induce fusion. This work shows that receptor recognition and G fusion activities can be decoupled. This paves the way to develop glycoproteins derived from G with modified tropism.In Rhabdoviruses, G is the only target of neutralizing antibodies. There is no structure of a Rhabdovirus G in complex with an antibody. The 8G5F11 antibody neutralizes several genotypes of the genus Vesiculovirus including VSV. We have shown that FAB 8G5F11 prevents infection of cells by VSV Indiana on the one hand and that they recognize the pre- and post-fusion form of VSV G with a 1: 1 G: FAB stoichiometry on the other hand. We have developed the observation conditions of the G-FAB complex in cryo-electron microscopy, which could be useful to obtain the structure of the G-FAB complex.We also started a study to characterize the glycoproteins of other Rhabdoviruses of the Lyssavirus genus. We produced and purified G ectodomains of rabies virus (RABV), Mokola virus (MOKV) and West Caucasian bat virus (WCBV). We characterize these G by electron microscopy at different pHs. The measurements made on G at pH 8 are compatible with those expected for a pre-fusion monomer of G. At pH 6, these ectodomains could correspond to a monomeric late intermediate in the structural transition. Obtaining the crystallographic structure of the G ectodomain of MOKV could validate these results.