Caractérisation moléculaire et biochimique des carbapénèmases les plus répandues chez les Entérobactéries associées à des infections sévères en vue de développer de nouveaux inhibiteurs

MOLECULAR AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF THE MOST POPULAR CARBAPENEMASES IN ENTEROBACTERIES ASSOCIATED WITH SEVERE INFECTIONS IN ORDER TO DEVELOP NEW INHIBITORS

• Auteur / Autrice : Saoussen Oueslati
• Direction : Thierry Naas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 02/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Structure dynamique, expression et fonction de bêta-lactamases de spectre large (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Ongeri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thierry Naas, Sandrine Ongeri, Jean-Yves Madec, Richard Bonnet, Samuel Bellais, Anaïs Potron, Sandra Da Re, Fanny Roussi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Yves Madec, Richard Bonnet, Samuel Bellais

Mots clés

Mots clés contrôlés

Inhibiteurs

Infections à entérobactéries

Résistance aux antibiotiques

Mots clés libres

Beta-Lactamases

Carbapénèmase

Inhibiteurs

Biochimie

Beta-Lactamases

Carbapenemase

Inhibitors

Biochemistry

Résumé

Les antibiotiques, et plus particulièrement les β-lactamines, furent pendant longtemps considérés comme l’arme absolue pour le traitement des infections bactériennes, du fait de leur efficacité, leur bonne tolérance et de leur faible coût. Cependant, les bactéries ont développé des mécanismes de résistance, y compris vis-à-vis des β-lactamines possédant le spectre d’activité le plus large, les carbapénèmes. Ces derniers sont considérés comme les antibiotiques de derniers recours pour le traitement des infections sévères à bacilles à Gram négatif en milieu hospitalier. Chez les entérobactéries, cette résistance émergente aux carbapénèmes est principalement due à l’expression d’enzymes appelées les carbapénèmases capables d’inactiver les carbapénèmes. L’émergence exponentielle à l’échelle mondiale de ces entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC) constitue un problème majeur de santé publique. Actuellement, les carbapénémases les plus répandues dans le monde sont les KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), NDM-1 (New Delhi metallo- β- lactamase) et OXA-48 (Oxacillinase). La première KPC a été identifiée en 1996 aux Etats- Unis, NDM-1 en 2009 en Suède chez une patiente en provenance d’Inde et OXA-48 en 2003 en Turquie. En France, les carbapénèmases de type OXA-48 sont largement majoritaires et représentent près de 70% des EPC. Ainsi, le retentissement de leur dissémination et le besoin de développer de nouveaux inhibiteurs capables d’inactiver les carbapénèmases se fait de plus en plus pressante.Cette thèse a pour objectif de mieux comprendre le mode d’ action de ces 3 carbapénèmases d’un point de vue moléculaire et biochimique, afin d’ identifier les éléments structuraux nécessaires à leur fonctionnement, mais aussi de poser les bases du développement de « pan-inhibiteurs » et de nouveaux outils de diagnostics. Pour cela, la caractérisation biochimique des carbapénèmases de type KPC, NDM et OXA-48, de leurs variants naturels et de mutants générés in vitro a été entreprise. Il a pu être mis en exergue l’implication de résidus spécifiques et d’éléments structuraux nécessaires à l’ hydrolyse des carbapénèmes. L ’ étude cristallographique et RMN ainsi que l’étude in silico (modélisation) de ces enzymes et de leurs mutants respectifs, nous a permis de mieux comprendre le mode d’ interaction enzyme- substrat. Nous avons ainsi pu comprendre les bases de la capacité impressionnante de ces carbapénèmases à s’adapter et à évoluer en fonction des pressions de sélections exercées.En collaborations avec différentes équipes de chimistes nous avons développés différentes séries de molécules « pan-inhibiteurs » capables d’inhiber les 3 classes de carbapénèmases. Ainsi nous avons montré un effet inhibiteur de certains composés de la famille des flavonoïdes dont la myrécétine, molécule la plus active. Nous avons également identifié une série de composés, les imidazolines, possédant un effet pan-inhibiteur avec des valeurs de CI50 sub-micromolaires et donc compatible avec une utilisation in vivo.Enfin, nous avons participé au développement (en collaboration avec le CEA) d’ un outil de diagnostic rapide basé sur l’immunochromatographie, permettant détection des EPC en moins de 15 minutes.

Antibiotics, and particularly ß- lactams, have long been considered the ultimate weapon for the treatment of bacterial infections, because of their effectiveness, good tolerance and low cost. However, bacteria have developed mechanisms of resistance, including against β- lactams with the broadest spectrum of activity, carbapenems. The latter are considered as last resort antibiotics for the treatment of severe infections due to Gram negative bacilli in hospital. This emerging resistance to carbapenems in Enterobacteriaceae is mainly due to the expression of enzymes called carbapenemases capable of inactivating carbapenems. The worldwide exponential spread of these carbapenemase-producing enterobacteria (CPE) represents a major public health issue. Currently, the most common carbapenemases in the world are KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), NDM-1 (New Delhi metallo-β-lactamase) and OXA-48 (Oxacillinase). The first KPC was identified in 1996 in the United States, NDM-1 in 2009 in Sweden in a patient from India and OXA-48 in 2003 in Turkey. In France, OXA-48- type are the most abundant carbapenemases with nearly 70% of the EPCs. Thus, the repercussion of their dissemination and the development of new inhibitors capable of inactivating carbapenemases is becoming more and more urgent.The aims of this thesis were to better understand the mode of action of the 3 main carbapenemases from a molecular and biochemical point of view, in order to identify the structural elements necessary for their functioning, but also to lay the basis for the development of ''pan-inhibitors'' and noveldiagnostic tools. For this purpose, the biochemical characterization of carbapenemases of the KPC, NDM and OXA-48 type, their natural variants and mutants generated in vitro has been undertaken.We could highlight the involvement of specific residues and structural elements necessary for the hydrolysis of carbapenems. The crystallographic and NMR study as well as the in silico (modeling) studies of these enzymes and their respective mutants, allowed us to better understand the enzyme-substrate interaction mode. We could thus understand the basis of the impressive capacity of these carbapenemases to adapt and therefore to evolve according to the selection pressures exerted.In collaboration with several chemists we participated in the development of different series of ''pan-inhibitors'' that were able to inhibit the 3 classes of carbapenemases. Thus we could show the inhibitory properties of some compounds of the family of flavonoids including myricetin, the most active molecule. We have also been able to identify a series of compounds, imidazolines, possessing a pan- inhibitory effect with sub-micromolar IC50 values and therefore compatible with in vivo use. Finally, we participated in the development (in collaboration with the CEA) of a rapid diagnostic tool based on theimmunochromatographic, allowing the detection of EPCs in less than 15 minutes.