Thèse soutenue

Analyse quantitative de la régulation du programme de réplication de l'ADN par le point de contrôle intra phase S dans les embryons de Xénope

FR  |  
EN
Auteur / Autrice : Diletta Ciardo
Direction : Kathrin MarheinekeArach Goldar
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance le 04/12/2019
Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
Jury : Président / Présidente : Sébastien Bloyer
Examinateurs / Examinatrices : Kathrin Marheineke, Arach Goldar, Sébastien Bloyer, Jean-Charles Cadoret, Annick Lesne, Laure Crabbé
Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Charles Cadoret, Annick Lesne

Mots clés

FR  |  
EN

Résumé

FR  |  
EN

Dans les organismes multicellulaires, plusieurs millier d’origines initient la réplication de l'ADN. Elles sont regroupées en domaines qui se répliquent tôt ou tard au cours de la phase S (origines précoces ou tardives). L'un des mécanismes régulant le programme de réplication est un point de contrôle intra phase S qui dépend des kinases ATR et Chk1. Cette voie est activée par un stress réplicatif engendré par le blocage des fourches de réplication aux origines précoces, en retour elle inhibe l’activation des origines tardives. Il a été proposé, que la protéine Polo-Like-Kinase 1 (Plk1) soit responsable du déclenchement des origines situées à proximité des fourches bloquées en cas de stress réplicatif. Cependant, aucune analyse de l’activation des origines n’a jamais été réalisée au cours d’une phase S non perturbée lorsque Plk1 est absente. Pour avoir une vue globale et unifiée du processus de réplication de l'ADN, des modèles numériques et analytiques ont été construits dans le passé, mais aucun d'eux n'intègrent le rôle de Chk1 et Plk1. L'objectif de ma thèse était d’étudier expérimentalement et analytiquement de quelle manière Chk1 peut réguler le déclenchement des origines dans l'espace et dans le temps. En particulier, de comprendre si Plk1 pouvait être impliquée dans cette régulation pendant une phase S non perturbée, à cette fin, j'ai utilisé le système réplicatif des extraits d’œuf de Xénopes. En premier lieu, j'ai intégré dans un modèle numérique l’action de Chk1 pour reproduire le programme de réplication du système Xénope. J'ai testé différents scénarios puis j’ai utilisé des données de peignage d'ADN obtenues précédemment dans des conditions d'inhibition de la kinase Chk1. Les simulations Monte Carlo obtenues ont été ajustées aux données expérimentales en optimisant les valeurs des paramètres libres des modèles. J'ai trouvé qu'il fallait ajouter deux hypothèses aux modèles de réplication développés précédemment: 1) la présence d’une forte inhibition du déclenchement des origines par Chk1 à partir du début de la phase S 2) la présence de domaines génomiques répliquant précocement et qui échappent à cette inhibition. Deuxièmement, j'ai montré expérimentalement que, Plk1 actif est recrutée sur la chromatine avant le début de la phase S non perturbée et qu'en l'absence de Plk1, la réplication de l'ADN est ralentie. De plus, l’absence de Plk1 entraîne une augmentation de la phosphorylation de Chk1 et une diminution de l’activité de la kinase Cdk2, ce qui suggère que Plk1 inhibe Chk1. En réalisant des expériences de peignage d’ADN, j'ai démontré qu’en l’absence de Plk1 on observe une baisse du niveau d’activation des origines. L'analyse de ces données par mon modèle numérique suggère que Plk1 régule négativement l’action de Chk1 levant ainsi son action inhibitrice sur l’activation globale des origines. Cet effet concorde avec mes observations expérimentales. Il semble cependant que Plk1 n’agisse pas à proximité directe des fourches de réplication, comme cela avait été proposé précédemment. Enfin, en assimilant le processus de réplication à un processus de nucléation et de croissance unidimensionnel, j'ai développé une nouvelle approche quantitative pour étudier la régulation du programme de réplication. Cette approche lie la similarité entre les profils spatiaux de réplication d'une molécule unique et les processus de régulation de la réplication de l'ADN. En analysant les données de peignage d'ADN, j'ai montré que le programme de réplication de l'ADN des embryons précoces de Xénope est régulé par deux processus exclusifs dans l'espace et dans le temps. L’un avec une fréquence faible d’activation des origines et une vitesse apparente de fourches élevée et un second, régulé par Plk1, présentant une fréquence d’activation élevée des origines avec une vitesse apparente de fourches faible.