Dynamique de la protéine Nox2 lors de la phagocytose

Nox2 Protein Dynamics during Phagocytosis

• Auteur / Autrice : Jérémy Joly
• Direction : Oliver Nüsse, Sophie Dupré-Crochet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 20/11/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie physique (Orsay, Essonne ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Karim Benihoud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Oliver Nüsse, Sophie Dupré-Crochet, Marie-Hélène Paclet, Emma Colucci-Guyon, Jean-Marc Verbavatz
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Hélène Paclet, Emma Colucci-Guyon

Mots clés

Mots clés contrôlés

NADPH Oxidase 2

Granulocytes neutrophiles

Microscopie à super-résolution

Endocytose

Phagocytose

Mots clés libres

Neutrophile

Phagocytose

NADPH Oxydase

Trafic cellulaire

Imagerie

Super-Résolution

Neutrophil

Phagocytosis

NADPH Oxidase

Cellular trafficking

Imaging

Super resolution

Résumé

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus nombreux et les premières cellules à arriver au site de l’infection où elles internalisent les pathogènes par phagocytose. Dès le début du processus, la NADPH oxydase s’assemble au phagosome où elle permet la production de formes réactives de l’oxygène contribuant ainsi à la destruction du pathogène. La sous-unité catalytique membranaire de la NADPH oxydase, Nox2, est donc présente à la coupe phagocytaire puis au phagosome. Le dessein de cette étude était de déterminer quelles sont les sources subcellulaires de la protéine Nox2, de savoir si la protéine s’accumule au phagosome et le cas échéant selon quelle cinétique. Dans le but de comprendre la dynamique de la protéine Nox2, la protéine d’échafaudage IQGAP1 qui est associée au cytosquelette a également été étudiée. Enfin l’étude de l’organisation spatiale de la protéine Nox2 à la synapse phagocytaire a également été abordé.En utilisant des cellules neutrophil-like (PLB-985) ainsi que des neutrophiles humains, notre étude a montré par immunofluorescence la présence de la protéine Nox2 dans des endosomes de recyclage ou dans des endosomes précoces. Lors de la phagocytose ils avoisinent le phagosome suggérant leur implication dans l’apport de la protéine Nox2 à la membrane de ce dernier. L’utilisation de cellules PLB-985 pour lesquelles l’expression de Nox2 a été supprimée puis réintroduite avec un transgène codant pour la protéine GFP-Nox2 montre que la sous-unité Nox2 s’accumule au phagosome pendant les vingt minutes suivant sa fermeture. Dans notre étude, la protéine IQGAP1 ne semble pas avoir d’effet sur la phagocytose ou sur la production de FRO par la NADPH oxydase. Enfin, grâce à une technique de microscopie super-résolution (le dSTORM) l’évolution du pattern de Nox2 dans la membrane a été évalué au cours du temps en phagocytose frustrée. En dix minutes, le nombre de clusters de protéine Nox2 augmente mais leur taille reste inchangée.

Neutrophils are the most numerous leukocytes and the first cells to arrive at the site of infection where they internalize pathogens by phagocytosis. From the beginning of the process, the NADPH oxidase is assembled at the phagosome, where it allows the production of reactive oxygen species (ROS), thus contributing to the destruction of the pathogen. The membrane bound catalytic subunit of the NADPH oxidase, Nox2, is therefore recruited at the phagocytic cup and then at the phagosome. The purpose of this study was to determine, which are the subcellular sources of the Nox2 protein, whether the protein accumulates at the phagosome and if so, according to which kinetics. In order to modify the dynamics of the Nox2 protein, the scaffold protein IQGAP1 that is associated with the cytoskeleton was also studied. Finally, the spatial organization of the Nox2 protein in the phagocytic synapse was also investigated.Using neutrophil-like cells (PLB-985) as well as human neutrophils, our study showed by immunofluorescence the presence of the Nox2 protein in recycled or early endosomes. During phagocytosis, they are close to the phagosome, suggesting their involvement in the contribution of the Nox2 protein to the phagosome membrane. The use of PLB-985 for which Nox2 expression has been suppressed and then reintroduced with a transgene encoding the GFP-Nox2 protein shows that the Nox2 subunit accumulates at the phagosome during the first twenty minutes after its closure. In our study, the protein IQGAP1 does not appear to have any effect on phagocytosis or on the production of ROS by NADPH oxidase. Finally, using super resolution microscopy (dSTORM) the evolution of the Nox2 pattern in the membrane has been evaluated over time in frustrated phagocytosis. Within ten minutes, the number of Nox2 protein clusters increases but their size remains unchanged.