Three-dimensional and multicolour approaches in super-resolution fluorescence microscopy for biology
Approches tri-dimensionnelles et multicolores en microscopie de fluorescence super-résolue pour la biologie
Résumé
Cell biology relies on imaging tools to provide structural and dynamic information about samples. Among them, fluorescence microscopy offers a compromise between high specificity and low toxicity. Recently, super-resolution methods overcame the diffraction barrier to unlock new fields of investigation. Single molecule approaches prove especially useful for three-dimensional nanoscale imaging, and allow couplings between different detection modalities. Still, their use is hindered by the complexity of the methods as well as the lack of reproducibility between experiments.We propose new methods to render super-localisation microscopy more easily applicable to relevant studies in cell biology, chemistry and material science. First, we introduce dedicated protocols and samples to eliminate sources of error in calibration and performance measurement acquisitions. We also provide examples of uses of three-dimensional super-localisation for state-of-the-art studies in the frameworks of cell adhesion and bacterial resistance to drugs.Then, we focus on the development of a novel optical method that provides unbiased results in three-dimensional single molecule localisation microscopy. This is achieved through the combination of two complementary axial detection strategies: point spread function shaping on the one hand, and supercritical angle fluorescence detection on the other hand. By cross-correlating and merging the lateral and axial positions provided by the different sources, we achieve quasi-isotropic localisation precisions down to 15 nanometres over a 1-micrometre capture range. We demonstrate the insensibility of the method to imaging non-idealities such as axial drift, chromatic aberration and sample tilt, and we propose applications in neurobiology and bacteria labelling.Finally, we introduce two new post-processing approaches for the demixing of simultaneous multi-species acquisitions. They are based respectively on the measurement of the spot sizes, and on the assessment of the dynamic blinking behaviour of molecules. After demonstrating a proof of principle, we assess the impact of the different parameters likely to influence the results. Eventually, we discuss leads to improve the demixing performances, and we discuss the coupling possibilities with complementary single molecule localisation techniques.
Pour analyser la structure et la dynamique des échantillons, la biologie cellulaire repose sur l'utilisation d'outils d'imagerie. En particulier, la microscopie de fluorescence offre une grande spécificité et une toxicité réduite. L'émergence récente des méthodes de super-résolution a permis d'outrepasser la limite de diffraction et ouvert de nouvelles perspectives d'études. Les stratégies de molécule unique sont particulièrement adaptées à l'imagerie nanométrique tridimensionnelle, et permettent de nombreux couplages avec des modalités complémentaires ; toutefois, leur manque de reproductibilité entrave leur généralisation.Nous proposons ici de nouvelles méthodes dans le but de remédier à ces problèmes en facilitant leur application en biologie cellulaire, en chimie et en science des matériaux. Tout d'abord, nous présentons des protocoles et échantillons dédiés aux acquisitions de calibration et de mesure de performances. Nous décrivons également plusieurs exemples d'utilisation de super-localisation tridimensionnelle dans le cadre d'études d'adhésion cellulaire et de résistance bactérienne.Ensuite, nous nous concentrons au développement d'une nouvelle méthode de microscopie de localisation de molécules uniques tri-dimensionnelle permettant l'élimination de biais de détection. Ceci est permis par le couplage entre deux stratégies complémentaires: la mise en forme de fonction d'étalement de point, et la détection de la fluorescence d'angle super-critique. L'intercorrélation et la recombinaison des informations latérales et axiales permet l'obtention d'une résolution quasi-isotrope, avec des précisions jusqu'à 15 nanomètres sur une plage de capture d'un micron. Nous mettons en évidence l'insensibilité de la méthode aux biais d'imagerie comme la dérive axiale, l'aberration chromatique et l'inclinaison de l'échantillon, et nous l'illustrons à travers des applications à la neurobiologie et au marquage de bactéries.Pour finir, nous présentons deux nouvelles approches pour le découplage d'acquisitions multi-espèces simultanées. Toutes deux basées entièrement sur le post-traitement des données acquises, elles exploitent respectivement la mesure des tailles des taches et le comportement dynamique du clignotement. Après une preuve de principe, nous évaluons l'impact des différents paramètres susceptibles d'influencer les résultats. Nous concluons en proposant des pistes d'amélioration des performances de découplage, et en suggérant de possibles couplages avec des méthodes complémentaires en imagerie de molécules uniques.
Origine : Version validée par le jury (STAR)