Discovery of a new type of regulator of DNA replication : the glycolytic enzyme pyruvate kinase in Bacillus subtilis

Découverte d'un nouveau type de régulateur de réplication ADN : l'enzyme glycolytique pyruvate kinase en Bacillus subtilis

• Auteur / Autrice : Steff Horemans
• Direction : Laurent Jannière
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 11/12/2019
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génomique métabolique (Evry, Essonne ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Jury : Président / Présidente : Bianca Sclavi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurent Jannière, Bianca Sclavi, Hannu Myllykallio, Dominique Le Coq, Jean-Luc Ferat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hannu Myllykallio

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pyruvate kinase

Bacillus subtilis

ADN -- Réplication

Mots clés libres

B. subtilis

Résumé

On sait depuis longtemps que le fenêtrage de la réplication de l'ADN dans le cycle cellulaire chez les bactéries varie avec la richesse en nutriments. Cependant, le mécanisme sous-jacent reste pour l’instant inconnu. Le but de ce travail est de déterminer si PykA, une enzyme du métabolisme central carboné (MCC), est impliquée dans ce contrôle temporel de la réplication chez la bactérie Bacillus subtilis et si, pour assurer cette fonction, PykA utilise une activité non-métabolique cryptique qui lui permet d’agir en tant qu'effecteur temporel de la réplication en transmettant des informations sur l'état métabolique de la cellule à l'appareil de réplication.Pour tester ces hypothèses, l’effet de mutations dans le gène pykA sur la réplication a été évalué dans un milieu de culture où son activité métabolique n’est pas nécessaire. Les paramètres de réplication dans ces mutants ont alors été mesurés par des approches de cytométrie en flux et de PCR quantitative.Nos résultats ont confirmé que la délétion de pykA n’a pas d’effet sur la croissance des cellules dans le milieu utilisé mais que cette mutation affecte le contrôle temporel de la réplication en modifiant l’âge d’initiation de la réplication et la vitesse de réplication. La délétion du domaine catalytique ou du domaine « PEP utilizer » de PykA a montré que chacun de ces domaines joue un rôle dans le contrôle temporel de la réplication, assignant pour la première fois une fonction de réplication à ces domaines. Une mutagenèse ciblée du domaine catalytique a montré que seulement certains acides aminés impliqués dans l’activité métabolique de PykA sont importants pour la réplication. La mutagenèse des acides aminés conservés dans le motif Thr-Ser-His (TSH) du PEP utilizer suggère un rôle important de la thréonine dans le contrôle temporel de la réplication. L'expression du PEP utilizer seul (non fusionné au domaine catalytique), a permis de découvrir plusieurs principes de réciprocité entre les deux domains. Enfin, des tests in vitro ont démontré que PykA peut directement stimuler l'activité de la polymérase DnaE et inhiber l'activité de l’hélicase DnaC. Ensemble, ces résultats indiquent que PykA a une activité cryptique de réplication.Pour démontrer que PykA transmet l'état métabolique de la cellule à la machinerie de réplication, l'effet de mutations dans pykA sur les paramètres de réplication de cellules subissant un changement métabolique a été évalué à l'aide des techniques décrites ci-dessus.Nous avons observé que l’adaptation des paramètres de réplication au cours du changement métabolique dans les cellules sauvages se déroule en trois phases: (i) une diminution progressive de la vitesse de la fourche de réplication de 15 à 45 minutes après le changement métabolique, (ii) une stimulation de l’initiation à partir du point 30 minutes et (iii) finalement une adaptation du taux de croissance après 45 minutes. Les mutations dans le domaine catalytique ne semblent pas avoir d’effet sur l’évolution de ces paramètres. En revanche, le PEP utilizer, fusionné ou non au domaine catalytique, affecte l’adaptation des paramètres de réplication par un processus nouveau dépendant de l'acide aminé His et non Thr du motif TSH. Ainsi donc, le PEP utilizer et plus généralement PykA, agit sur la réplication selon des voies particulières en fonction du métabolisme.Nous concluons que PykA est un nouveau type de régulateur de la réplication de l’ADN qui facilite le positionnement temporel de la réplication par le biais de processus variant avec la richesse des sources de carbone fournies dans l’environnement. Ces travaux, combinés à des travaux antérieurs dans ce domaine, suggèrent que le contrôle temporel de la réplication dans un large éventail de conditions de croissance métabolique est réalisé au moins en partie via un réseau d'enzymes MCC ayant des activités cryptiques. Cette conclusion a des implications importantes dans notre compréhension de la biologie cellulaire.

It has been known for decades that the timing of DNA replication within the cell cycle in bacteria is coupled to nutrient richness. However, the mechanisms that enable this temporal gating have remained elusive. The goal of this work was to test whether the CCM enzyme PykA in the bacterium B. subtilis helps achieve this gating by moonlighting as a temporal effector of replication that communicates information about the metabolic state of the cell to the replication machinery.To demonstrate that PykA moonlights as a replication protein, the effect of pykA mutations on DNA replication parameters was assessed using run-out flow cytometry and marker frequency analysis by qPCR in growth conditions where its metabolic activity is dispensable.Deletion of pykA did not affect the growth rate during these conditions, but it affected the replication speed and timing of initiation, altering therefore the temporal control of replication. The deletion of either the catalytic domain or the PEP utilizer domain of PykA showed that both domains play a role in the temporal control of replication, identifying for the first time a replication function to these domains. Mutagenesis of specific amino acids inside the catalytic domain showed that some, but not all key catalytic amino acids are involved in replication. Mutagenesis of conserved amino acids in the TSH motif of the PEP utilizer on the other hand suggests an important role for threonine phosphorylation. Expression of the PEP utilizer detached from the catalytic domain in trans unexpectedly affected replication control at medium copy numbers. This phenotype depended strictly on H of the TSH motif, establishing a role for H in replication. Furthermore, the effect of expression of free PEP utilizer may depend of an unidentified inhibitor effector and is fully suppressed by a mutation in the catalytic domain. Moreover, expression of the catalytic domain in cis and the PEP utilizer in trans did not restore proper replication control. Finally, in vitro assays demonstrated that PykA can directly stimulate DnaE polymerase activity and inhibit DnaC helicase activity. Together, these results imply that PykA moonlights in replication.To demonstrate that PykA communicates information about the metabolic state of the cell to the replication machinery, the effect of pykA mutations on DNA replication parameters during a metabolic shift was assessed using the techniques described above.The adaptation of replication parameters during the metabolic shift in wild type cells unexpectedly consisted of three phases: (i) a decrease of replication fork speed between 15 and 45 min after the shift, (ii) an advancement of initiation timing and increase in initiation frequency from 30 min onwards and (iii) an adaptation of the growth rate sometime after 45 min after the shift. Mutations in the catalytic domain did not clearly demonstrate a change in the replication response to the shift. By contrast, the effect of the PEP utilizer domain (both in cis and in trans) on replication parameters did change during the shift. Moreover, the H amino acid, not T, was important for replication control during later time points of the shift. This suggests that the regulatory behaviour of the PEP utilizer and more generally PykA changes in response to metabolism.Overall, we conclude that PykA is a new type of regulator of DNA replication that helps the temporal positioning of replication in the cell cycle through processes that varies with the richness of the carbon sources provided in the environment. This work, combined with previous work in this field suggest that the temporal control of replication in a large range of metabolic growth conditions is achieved at least in part via a network of moonlighting CCM enzymes with important implications for our basic understanding of cell biology and human health.