Caractérisation fonctionnelle des longs ARN non codants associés à la transition épithélio-mésenchymateuse

Functional characterization of long non-coding RNAs associated with the epithelial-to-mesenchymal transition

• Auteur / Autrice : Julien Jarroux
• Direction : Antonin Morillon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génomique
• Date : Soutenance le 23/09/2019
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique de l'information génétique : bases fondamentales et cancer (Paris ; 2009-....) - Dynamique de l'information génétique : bases fondamentales et cancer
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Alain Puisieux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antonin Morillon, Alain Puisieux, Eleonora Leucci, Maite Huarte, Marina Pinskaya, Jean-Christophe Andrau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eleonora Leucci, Maite Huarte

Mots clés

Mots clés libres

Transition épithélio-Mésenchymateuse

Longs ARN non codants

Humain

Epithelial-To-Mesenchymal transition

Long noncoding RNA

Human

Résumé

Depuis dix ans, les techniques de séquençage haut-débit ont montré l’incroyable complexité du transcriptome humain, révélant une nouvelle classe d’ARN : les longs ARN non codants (lncARN). Depuis, leur expression a été démontré comme spécifique au type cellulaire ou aux variations pathologiques, et c’est notamment le cas du cancer où ils sont fortement dérégulés. Cependant, les mécanismes par lesquelles ils agissent dans le développement tumoral restent peu caractérisés. Aussi, ce projet vise à faire une caractérisation fonctionnelle des lncARN dans la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), un processus biologique associé à la métastase.A partir d’un modèle unique de TEM (Castro-Vega et al, 2013), l’analyse transcriptomique de fractions subcellulaires (cytoplasme et chromatine) ont permis d’identifier une signature de lncARN différentiellement exprimés dans les cellules épithéliales ou mésenchymateuses. Leur expression et localisation subcellulaire a ensuite été confirmé. Aussi, l’annotation de ces nouveaux transcrits a été validée par l’analyse des marques d’histones associées à leur régulation.Dans le but de déterminer quels lncARN identifiés sont fonctionnels dans la TEM, un crible d’activation par CRISPR (CRISPRa à l’échelle du génome a été mis au point en collaboration avec Neville Sanjana (NYU) pour activer l’expression de lncARN et définir leur rôle au travers de deux phénotypes associés à la TEM : les capacités d’invasion des cellules et les variations d’expression d’un marqueur de surface associée à l’identité épithéliale (EpCAM).En plus du crible, un nouveau lncARN a été identifié dans les cellules mésenchymateuses et sa caractérisation fonctionnelle a montré que son expression conduit à une perte de certains marqueurs épithéliaux ainsi qu’une augmentation drastique des capacités migratoires, lorsqu’il est surexprimé dans les cellules épithéliales.Pour résumer, de multiples approches haut-débit ont été utilisées pour caractériser le transcriptome non-codant associé à la transition épithélio-mésenchymateuse et ont permis d’identifier de nouveaux longs ARN non codants impliqués dans sa régulation.

In the last decade, new high-throughput sequencing techniques have revealed the complexity of the human transcriptome, allowing the characterization of long non-coding (lnc)RNAs. These transcripts have been reported as very specific to tissues, developmental stages and pathological variations such as cancer. However, mechanisms through which they may act in the promotion of cancer are still poorly characterized. In my PhD project, I investigated the role of lncRNAs and their association to the epithelial to mesenchymal transition (EMT), a biological process which has been linked to metastasis and cancer progression.Using transcriptomic approaches from total and subcellular-fractionated RNA extracts from a cell system that models EMT (Castro-Vega et al, 2013), I identified over a thousand differentially expressed yet unannotated lncRNAs. Then I validated their expression, subcellular localization and the chromatin marks associated with their regulation.In order to assess whether these new lncRNA are functional in the EMT, I designed a CRISPR-activating (CRISPRa) screen using a dead Cas9 fused to transcription activating proteins (in collaboration with the lab of Neville Sanjana, NYU). This screen is based on two main phenotypes associated with the EMT: invasion capacity of the cells, and expression of an epithelial surface marker (EpCAM).In addition to the CRISPRa screening, I identified a novel lncRNA in mesenchymal cells which leads to a loss of epithelial markers and an increase in migration capacities when overexpressed in epithelial cells.Altogether, I used a combination of high-throughput methods to characterize the non-coding transcriptome associated to the EMT and identify yet unannotated transcripts which are functional in its regulation.