Rôle de la nouvelle isoforme d’épissage du gène von Hippel-Lindau dans la survenue d’érythrocytoses et de cancers du rein héréditaires

Role of the new splicing isoform of gene von Hippel-Lindau in the development of Erythrocytosis and hereditary renal cancer

• Auteur / Autrice : Marion Lenglet
• Direction : Betty Gardie
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire et sciences de la santé
• Date : Soutenance le 24/09/2019
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de l'École pratique des hautes études (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Établissement de préparation de la thèse : École pratique des hautes études (Paris ; 1868-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie et Immunologie Intégrée Nantes Angers (1979-....)
• Jury : Président / Présidente : Yannick Arlot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Betty Gardie, Yannick Arlot, Isabelle Plo, Claude Houdayer, Frédéric Mazurier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Plo, Claude Houdayer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Gène VHL

Épissage (génétique)

Mots clés libres

Hypoxie

Hypoxia

Splicing

VHL (gene)

Résumé

La protéine von Hippel-Lindau (VHL), codée par le gène VHL constitué de 3 exons, est un facteur clé de la régulation de la voie de l’hypoxie dont l’acteur majeur est le facteur de transcription inductible en hypoxie (HIF). En présence d’oxygène, HIF est reconnue par VHL puis ubiquitinylée et dégradée via le protéasome. En absence d’oxygène, HIF est stabilisé et induit l’expression d’une centaine de gènes impliqués notamment dans l’angiogenèse (VEGF), la prolifération (TGF), le métabolisme (GLUT1) et l’érythropoïèse (EPO). Quand VHL est muté, HIF est n’est plus dégradé et entraine la surexpression de ces gènes qui peuvent conduire à la formation de tumeurs via l’hypervascularisation et l’hyperprolifération cellulaire ou à une érythropoïèse incontrôlée. Deux pathologies sont associées à des mutations de VHL. La polyglobulie, caractérisée par un taux de globules rouges sanguins et d’EPO élevés, a pour origine une mutation homozygote ou hétérozygote composite de VHL. La maladie de VHL, caractérisée par le développement de tumeurs hypervascularisées (hémangioblastomes du système nerveux central ou de la rétine, phéochromocytomes, paragangliomes ou cancers du rein), a pour origine une mutation hétérozygote de VHL associée à une perte d’hétérozygotie dans les tumeurs. Il a été mis en évidence que les mutations dans le gène VHL suivent un modèle d’oncogenèse en gradient : plus la perte de fonction de pVHL est importante, plus la pathologie développée est sévère. Cependant, certains patients présentent un tableau clinique caractéristique d’une anomalie VHL sans aucune mutation (maladie de VHL) ou seulement à l’état hétérozygote (polyglobulie). Les mécanismes moléculaires à l’origine de ces phénotypes n’étant pas encore compris, l’objectif de ma thèse s’est porté sur l’étude de mutations complexes de VHL, à savoir des mutations impactant l’épissage du gène. Une étude approfondie a été réalisée sur 12 familles : étude de ségrégation, analyse phylogénétique, tests minigènes, séquençage de l'ARN des tumeurs et lignées lymphoblastoides de patients, mesure de l'expression des ARNm et des protéines, études fonctionnelles des nouvelles isoformes VHL. L’épissage étant un mécanisme dépendant du type cellulaire, j’ai également participé au développement d’un modèle de cellules productrices d’EPO à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) de patients afin de réaliser des études adaptées. Le début de mon projet s’est porté sur l’étude de 2 mutations synonymes de l’exon 2 du gène VHL, à l’origine de la maladie de VHL ou d’une polyglobulie. J’ai pu mettre en évidence que ces mutations entrainent le saut de l’exon 2 dans les transcrits avec une diminution de l’isoforme sauvage (contenant les exons 1, 2 et 3) en faveur de celle contenant les exons 1 et 3, décrite comme non fonctionnelle. J’ai ainsi pu montrer que des mutations exoniques de VHL pouvaient être à l’origine de défauts d’épissage et entrainer une perte de fonction de VHL expliquant les phénotypes observés. L’étude approfondie des transcrits VHL m’a permis de mettre en évidence la présence de 2 exons cryptiques situés dans les introns 1 et 2. Ces 2 exons nommés E1’ et E2’ ont été séquencés et retrouvés mutés dans les cas inexpliqués de la maladie de VHL ou de polyglobulie. J’ai pu montrer que les mutations dans E1’ conduisent à une rétention excessive de cet exon associée à une diminution de l’expression protéique totale de VHL. Dans les deux cas (saut de l’exon 2 ou rétention de E1’), l’impact sur l’épissage est plus important chez les patients avec tumeurs qu’avec une polyglobulie. L’analyse des mutations de E2’ n’a pas encore permis de déterminer les mécanismes d’action en jeu. Lors de ma thèse, j’ai donc découvert une structure et une expression complexes du gène VHL. Mon travail a permis d’identifier l’origine de la pathologie chez des patients jusqu’ici sans diagnostic génétique, leur permettant un meilleur suivi médical et ouvrant sur de nouvelles pistes thérapeutiques.

The von Hippel-Lindau protein (VHL), encoded by the VHL gene that contains three exons, is a key factor of the hypoxia pathway. The main player of this pathway is the hypoxia inducible factor (HIF). In presence of oxygen, HIF is recognized by VHL, then ubiquitinylated and degradated by the proteasome. In absence of oxygen, HIF is stabilized and induces the expression of hundreds of genes involved in angiogenesis (VEGF), proliferation (TGF), metabolism (GLUT1) and erythropoiesis (EPO). When VHL is mutated, HIF is not degraded and induces the overexpression of these genes which can led to the formation of tumors via the hypervascularisation and the hyperproliferation of the cells or to an excessive erythropoiesis. Two pathologies are associated with mutations in VHL. The erythrocytosis is characterized by an elevated level of red blood cells and EPO serum level associated with homozygous or compound heterozygous mutations of VHL. The VHL disease is characterized by the development of hypervascularized tumors (hemangioblastomas of the central nervous system or of the retina, pheochromocytomas, paragangliomas or renal cancers) associated with heterozygous mutations of VHL and a loss of heterozygosity in tumors. It has been described that VHL mutations followed a continuum model of tumor suppression: the more severe is the loss of pVHL function the more severe is the developed pathology. However, some patients presented with a clinical aspect typical of VHL mutations but without any identified mutation (VHL disease) or with only heterozygous mutation (erythrocytosis). The molecular mechanisms at the origin of these phenotypes are not yet understood, the aim of my thesis was to study complex mutations of VHL, namely mutations that impact VHL splicing. A comprehensive study has been performed on twelve families: segregation study, phylogenetic analysis, minigene experiments and sequencing of RNA from tumors or lymphoblastoid cell lines of patients, measurement of the expression of mRNA and proteins, functional study of the new VHL isoforms. The splicing being specific to cell types, I also participated to the development of an EPO producing cellular model established from induced pluripotent stem cells (iPS) derived from patients. The beginning of my project was focused on the study of two synonymous mutations located in the second exon of the VHL gene, one associated with a VHL disease and one associated with an erythrocytosis. I demonstrated that these mutations induce the VHL exon 2 skipping associated with a decreased expression of the normal transcript (containing exon 1, 2 and 3 spliced) in favor of transcripts that contain exon 1 spliced with exon 3, a non-functional isoform. I showed that exonic mutations in VHL can induce splicing defects and led to a loss of function of VHL at the origin the observed phenotypes. In-depth study of VHL transcripts allowed the discovery of two cryptic exons located in the introns 1 and 2 of VHL. These two exons named E1’ and E2’ have been sequenced and found mutated in unsolved cases of VHL disease or erythrocytosis. I showed that mutations in E1’ led to an excessive retention of this exon associated with a decreased expression of VHL protein. In addition, comparative studies of synonymous and E1’- VHL mutations associated with von Hippel-Lindau or erythrocytosis confirmed the continuum model of tumor suppression. Analyses of the mutations in the E2’ exon have not yet permitted to identify the processes involved in the developed diseases. During my thesis, I have therefore demonstrated that exon-skipping and cryptic-exon-retention are new VHL alterations and I identified a novel complex splicing regulation of the VHL gene. This study allowed the identification of the patients’ disease origin who had so far no genetic diagnosis. These results provided access of patients to a better medical monitoring and paved the way of further therapeutic prospects.