Analysing the role of secretion systems in the physiology and pathogenesis of Brucella

par Elia Riquelme Zubiria

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de David O'Callaghan.


  • Résumé

    La brucellose est une zoonose courante causée par des bactéries du genre Brucella. La maladie humaine représente une cause importante de morbidité dans le monde entier alors que la brucellose animale est associée a d’importantes pertes économiques dues majoritairement aux avortements et à l’infertilité chez les ruminants. La survie et la réplication des bactéries du genre Brucella à l’intérieur de cellules phagocytiques et non-phagocytiques dépend du système de sécrétion de type IV (T4SS) qui sécrète des effecteurs protéiques. Ces effecteurs sont capables de sentir et de modifier la biologie de la cellule hôte. Les séquences génomiques de Brucella n’ont pas montré d’autres systèmes de sécrétions spécialisés. Cependant, elles révèlent la présence du système Tat (twin arginine translocator). Cette étude porte sur le T4SS, très bien caractérisé, ainsi que sur le système Tat chez Brucella suis. Pour comprendre les mécanismes utilisés par Brucella pour délivrer ses effecteurs protéiques appartenant au T4SS, nous avons montré que le résidu Gly295 de la protéine VirB10 chez B. suis, situé au sein d’un gate domain (GxxGxxG) proche de la région antenna projection, contribue à la régulation du transfert de substrat à travers la membrane externe. Ceci a été validé à l’aide du système rapporteur CyaA qui indique une translocation plus importante des effecteurs de Brucella chez le mutant VirB10G295R. Il a été possible d’en conclure que la mutation G295R empêche le T4SS de réguler la sécrétion de ses effecteurs. Cela suggère donc que le canal adopte une conformation ouverte de façon constitutive ce qui conduit à une libération non régulée des effecteurs protéiques. Il est possible que Brucella puisse également sécréter des effecteurs via la voie Tat. Le système Tat est présent dans de nombreuses, mais pas de façon ubiquitaire, bactéries et est utilisé pour l’export de protéines repliées du cytosol à l’enveloppe bactérienne ou l’environnement extracellulaire. Un criblage in silico du génome de Brucella a été réalisé en utilisant le signal N-terminal SRRxFLK qui a révélé 27 substrats potentiels de ce système. Dans ce travail, malgré l’utilisation de diverses techniques, l’obtention d’un mutant tat de Brucella n’a pas été possible. Plus important, une analyse bio-informatique a indiqué que plusieurs des substrats prédits de Tat encodés par le génome de Brucella sont essentiels à de nombreux mécanismes physiologiques de la bactérie. De plus, des données de TnSeq ont établies que tatC est un gène essentiel. De ce fait, un autre système rapporteur in vivo a été utiliser pour confirmer la dépendance au système Tat des substrats prédits précédemment. Grâce à cette stratégie, il a été montré qu’un système hétérologue construit chez E. coli fonctionne pour identifier les séquences signal du système Tat de Brucella. En conclusion, ces travaux suggèrent que le système Tat est un système de transport protéique essentiel à la viabilité des bactéries du genre Brucella. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes de translocations des effecteurs protéiques du T4SS et donnent des informations sur la façon dont la voie Tat contribue à la physiologie de Brucella. Comprendre la biologie des bactéries responsables de la Brucellose est une étape essentielle pour le développement de mesures de contrôle.

  • Titre traduit

    Analyse du rôle des systèmes de sécrétion dans la physiologie et la pathogenèse de Brucella


  • Résumé

    Brucellosis is a widespread zoonotic disease caused by bacteria of the genus Brucella. The human disease represents an important cause of morbidity worldwide whereas animal brucellosis is associated with serious economic losses caused mainly by abortion and infertility in ruminants. Brucella virulence depends on its ability to survive and replicate within host cells. This requires the Brucella VirB type IV secretion system (T4SS). The T4SS translocates effector proteins which subvert the host cell biology and defences, allowing it to create a novel intracellular niche in which it survives and multiplies.The VirB T4SS is a multi-protein complex encoded by the 12 genes of the virB operon. While there is some information on the structure of the VirB T4SS, little is known about the mechanisms that Brucella uses to deliver T4SS effectors. In this thesis we showed that the Gly295 of VirB10 in B. suis, a residue within a conserved gate motif (GxxGxxG) near the antenna projection region, contributes to the regulation of substrate transfer across the outer membrane. This was validated with the CyaA reporter system which indicates a higher translocation of Brucella effectors in the VirB10G295R. We can conclude that the G295R mutation renders the T4SS unable to regulate the secretion this suggests, a constitutively open channel conformation that leads to the unregulated release of effector proteins.The VirB T4SS is the only complex secretion system used by Brucella.Brucella does use two transport systems to export proteins from the cytoplasm; the Sec system and the Tat system. Tat is present in many, but not all, bacteria and is used to export folded proteins from the cytosol to the bacteria envelope or to the extracellular environment. There have been no reports of investigation of the Brucella Tat system. . An in-silico screen of the Brucella genome using the consensus N-terminal signal SRRxFLK revealed 27 potential substrates. To investigate the role of the Tat system in Brucella physiology ad virulence, we attempted to create a Brucella tat mutant using several strategies: none were successful. Analysis of the predicted Tat substrates showed that several could be essential physiological processes, explaining why we could not mutate the Brucella Tat system. . Moreover, Tn-Seq data from the De Bolle group identified tatC as an essential gene. Therefore, we have used an alternative in vivo reporter system to confirm the Tat dependency of the predicted substrates. We proved that a heterologous system constructed in E. coli works to identify Brucella Tat signal sequences. Altogether, we proposed that the Tat system is an essential protein transport system for viability in Brucella spp. Our results contribute to a further understanding of the mechanisms of translocation of T4SS protein effectors and give information about how the Tat pathway is contributing to the role of physiology of Brucella. Understanding the biology of the pathogen that causes brucellosis is an essential step in the development of control measures.



Le texte intégral de cette thèse sera accessible sur intranet à partir du 13-12-2022

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