Functional characterization of the tolerance to DNA damage of early embryos

Caractérisation fonctionnelle de la tolérance aux endommagements de l’ADN des embryons précoces

• Auteur / Autrice : Elena Lo Furno
• Direction : Domenico Maiorano
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 25/11/2019
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de génétique humaine (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Anne-Marie Martinez
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Béatrice Rondinelli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julian Sale, Pierre Savatier

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Altération

Cellules souches embryonnaires

Mutagenèse

Mots clés libres

Mutagenese

Cellules souches embryonnaires

Tolerance aux endommagements de l'ADN

Mutagenesis

Embryonic stem cells

Tolerance of DNA damages

Résumé

Afin de sauvegarder la stabilité du génome après exposition aux agents génotoxiques, les cellules possèdent un système de surveillance, connu comme «checkpoint », qui permet de bloquer le cycle cellulaire en présence de lésions de l’ADN ou suite à un ralentissement de la synthèse d’ADN (stress réplicatif). De façon surprenante, on sait depuis longtemps que le checkpoint des dommages à l’ADN n'est pas fonctionnel pendant l’embryogenèse précoce.Pendant l’embryogenèse précoce du xénope, le checkpoint dépendent de la kinase ATR est supprimé par le recrutement constitutif des ADN polymérases translésionnelles au niveau des fourches de réplication, ce qui empêche la formation d’ADN simple brin, un substrat critique pour activer le checkpoint. Ce phénomène est du a la présence de l’ubiquitine ligase Rad18 en quantité élevée dans les embryons précoces et comporte la monoubiquitination constitutive de la protéine de la fourche de réplication PCNA. Cette modification postraductionnelle est indispensable pour activer la synthèse d’ADN translésionnelle. Puisque la translésion est infidèle, en particulière sur l’ADN non endommagé, on peut supposer que les embryons précoces accumulent des mutations.A fin du déterminer la contribution de la synthèse translésionnelles pendant l’embryogenèse précoce, j’ai utilisé le xénope et la drosophile comme systèmes modèles.D’abord, j’ai observé la présence d’un niveau élevé de PCNA monoubiquitiné pendant l’embryogenèse précoce de la drosophile, qui diminue en proximité de la transition de midblastula (MBT), ce qui suggère que ce phénomène est aussi conservé chez les invertébrés. En plus, j’ai mesuré la mutagénèse pendant les divisions embryonnaires précoces de la drosophile et du xénope et j’ai observé un taux de mutation plus élevé que les cellules somatiques, néanmoins équivalent à celui connu pour la synthèse translésionnelle. Chez les xénope, j’ai aussi observé que la présence de ces mutations dépend de l’activité de Rad18. Puisque Rad18 est aussi implique dans la recombinaison homologue, j’ai utilisé diffèrent mutants de cette protéine et observé une contribution différentielle de Rad18 dans la nature et la fréquence des mutations. Ces résultats indiquent que les mutations générées pendant l’embryogenèse précoce du xénope dépendent de la recombinaison homologue et de la synthèse translésionnelle, et sont régulé par Rad18. Dans l’ensemble, ces résultats montrent que la synthèse translésionnelle est active pendant l’embryogenèse précoce des invertébrés et des vertébrés, et que la réplication de l’ADN favorise la mutagenèse pendant les premières divisions embryonnaires. Ceci pourrait constituer un nouveau mécanisme de diversité génétique qui contribue au polymorphisme génétique de l’organisme adulte.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai aussi commencé à caractériser les bases moléculaires responsables du stress réplicatif chronique génère pendant la prolifération rapide des cellules souches embryonnaire de souris. Ces cellules prolifèrent très rapidement, car les phases G1 et G2 du cycle cellulaire sont presque absents et le checkpoint de la transition G1/S est supprimé même en présence d’endommagements de l’ADN. Puisque ces endommagements sont génères et tolères par ces cellules, les possibles conséquences de la présence d’ADN endommagé sur l’intégrité du génome sont inconnues. J’ai identifié un candidat potentiel responsable de la présence chronique de stress réplicatif chez les cellules embryonnaire de souris. Ces données peuvent représenter la base pour des études futures, qui peuvent amener à mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la tolérance des lésions de l’ADN chez les cellules pluripotents.

Cells own mechanisms of genome surveillance known as checkpoints to preserve genome integrity upon exposure to genotoxic agents. These mechanisms allow to block the cell cycle in presence of DNA lesions, or to slow down DNA synthesis (replication stress). Intriguingly, DNA damage checkpoints are inefficient during early embryogenesis. In early Xenopus laevis embryos it was previously shown that the ATR-dependent DNA damage checkpoint is largely suppressed by constitutive recruitment of Y-family translesion synthesis (TLS) DNA polymerases onto replication forks, which prevents single-stranded DNA accumulation, a critical substrate for checkpoint activation. This phenomenon depends upon Rad18 abundancy, which leads to constitutive monoubiquitination of the replication fork protein PCNA (PCNAmub), necessary to activate translesion DNA synthesis. Because TLS is error-prone, especially on undamaged templates, these observations imply the possible occurrence of mutagenesis during early embryogenesis.In the aim to determine the contribution of TLS in mutagenesis during the replication cycles of early embryos, I have taken advantage of two biochemically and genetically amenable model organisms such as Xenopus laevis and Drosophila melanogaster. First, I have shown the presence of a constitutive high level of PCNAmub also during Drosophila embryogenesis, declining close to the Mid-Blastula Transition (MBT), suggesting that constitutive TLS activation is also conserved in invertebrates. Next, I have measured mutagenesis during the early embryonic replication cycles and observed a mutation rate much higher than that of somatic cells, and within the range of that observed for TLS polymerases. I have also observed that the occurrence of mutations depends upon the activity of the Rad18 ubiquitin ligase. Since Rad18 is involved in homologous recombination, I have used separation of function mutants and found a differential contribution of Rad18 in the nature and frequency of mutations. These results indicate that the occurrence of mutations depends on both Rad18-mediated TLS and homologous recombination activities. On the whole, these findings demonstrate that TLS is active during early embryogenesis and that DNA replication is mutagenic during the rapid cell cycles of early Xenopus and Drosophila embryos. This may constitute a novel mechanism generating genetic diversity and contributing to the polymorphisms in each individual.In the second part of my thesis, I have also started to characterize the sources of chronic replication stress of mouse embryonic stem cells (mESCs). These cells proliferate very rapidly due to a highly contracted cell cycle in which Gap phases (G1 and G2) are virtually absent and the G1/S checkpoint that arrest the cell cycle in the presence of DNA damage is suppressed. How the damage is generated and tolerated in these cells, and what are the consequences of such a high load of unrepaired DNA on the integrity of the genome is currently unknown. I have identified a possible candidate responsible for the occurrence of chronic replication stress in mESCs. These results may represent the basis for future studies leading to understanding the molecular mechanisms that make embryonic cells to tolerate DNA damage.