Identification and analysis of bacterial factors important for intramacrophage stages of Burkholderia cenocepacia using the zebrafish model

par Yara Tasrini

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Annette C. Vergunst.

Le président du jury était Laurent Kremer.

Le jury était composé de Annette C. Vergunst, Laurent Kremer, Romé Voulhoux, Peter Mergaert, Annemarie Meijer.

Les rapporteurs étaient Romé Voulhoux, Peter Mergaert.


  • Résumé

    Les bactéries apparentant au complexe Burkholderia cepacia sont des pathogènes opportunistes chez les patients atteints de mucoviscidose, et sont responsables de sérieuses infections chez les individus immunodéprimés. Ces bactéries sont intrinsèquement résistantes aux antibiotiques cliniquement utilisés, ce qui complique le traitement et la prévention des infections. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour développer de nouvelles stratégies antimicrobiennes afin de combattre les infections causées par le Bcc.Nous avons récemment démontré que les macrophages sont essentiels pour la réplication de Burkholderia cenocepacia, et pour le développement d’une infection pro-inflammatoire aigue et fatale dans des embryons de poisson zèbre. Le premier objectif de cette thèse est d’utiliser la technique de TraDIS (transposon-directed insertion sequencing) pour détecter des mutants atténués en virulence dans les embryons de poisson zèbre. Le séquençage parallèle massif des séquences d’insertion suivi d’analyses bioinformatiques a révélé un biais d’insertion du transposon Himar1, avec plus de 70% des « reads » présents dans des séquences codantes pour des ARNt et ARNr, pour des raisons toujours méconnues. L’analyse des séquences restantes a identifié plusieurs mutants absents ou sous-représentés à 8 et 18 heures post-infection, dont des mutants dans le cluster afc, impliqué dans la production d’un composé doté d’une activité antifongique. Cette découverte est en accord avec des études récentes de notre laboratoire, qui démontrent que le régulateur transcriptionnel ShvR, ainsi que sa cible afc, sont essentiels pour le switch entre une infection persistante et une infection aigue causée par B. cenocepacia K56-2 dans des embryons de poisson zèbre. Ceci confirme la possibilité d’identification de facteurs bactériens importants pour la virulence des bactéries intracellulaires dans les embryons de poisson zèbre, en utilisant la technique de mutagenèse de transposon couplée au séquençage parallèle massif.B. cenocepacia H111 est une souche proche de K56-2, mais moins virulente dans différents modèles animaux. Nous avons montré que l’expression constitutive de shvR dans H111 augmente la virulence de la souche dans les embryons de poisson zèbre, à un niveau similaire à K56-2, dépendamment de la présence de afc. Ceci renforce notre hypothèse que AFC est un facteur clé pour la virulence aigue, et que la différence de pathogénicité observée entre différentes souches pourrait être due à des différences de régulation.En un second objectif, nous avons analysé dans des embryons de poisson zèbre, le rôle de différents facteurs bactériens déjà établis importants pour la virulence de B. cenocepacia K56-2 dans d’autres modèles. Nous avons montré que le mutant de la zinc métalloprotéase zmpA est atténué en virulence. Des résultats antécédents obtenus dans notre laboratoire ont montré que B. cenocepacia K56-2 déclenche l’autophagie dans des macrophages infectés, dans les embryons de poisson zèbre, visualisé par le marquage des vacuoles contenant les bactéries par Lc3-GFP. Nous avons observé que les vacuoles contenant le mutant zmpA recrutent moins de Lc3-GFP que le wildtype. Nos résultats suggèrent que ZmpA contribue au déclenchement de l’autophagie et à l’inflammation, dans les macrophages infectés.Des études plus poussées seront nécessaires afin de déterminer la corrélation entre les facteurs bactériens, l’induction de l’autophagie, ainsi que l’ampleur de la réponse pro-inflammatoire, ce qui pourrait mener à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques contre ces pathogènes opportunistes importants.

  • Titre traduit

    Identification et analyse des facteurs bactériens impliqués dans les stades intra-macrophagiques de Burkholderia cenocepacia chez le poisson zèbre


  • Résumé

    Bacteria belonging to the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are life threatening opportunistic pathogens of cystic fibrosis patients and an emerging cause of serious infections in immune-compromised individuals. These bacteria are intrinsically resistant to clinically used antibiotics, which complicates disease management and treatment. Therefore, it is important to identify and develop new antimicrobial strategies to counteract Bcc infections.It has recently been shown that macrophages are essential for replication of Burkholderia cenocepacia and for triggering acute pro-inflammatory and fatal infection in zebrafish larvae. A major objective of this thesis was to apply Transposon-Directed Insertion Sequencing (TraDIS) to detect mutants with reduced intracellular survival and virulence in zebrafish embryos. Massive parallel sequencing of insertion sequences followed by bioinformatics analysis showed that the use of Himar1 transposon resulted in a large bias for insertion in rRNA and tRNA genes, with over 70% of reads mapped to these genes for yet unknown reasons. Although based on one biological experiment, analysis of the remaining insertion sequences identified several mutants that were absent or underrepresented at 8 and 18 hours post infection, including mutants of the afc cluster, a gene cluster that specifies the production of a compound with antifungal activity. This finding is in agreement with recent studies in the laboratory, showing that the LysR-type transcriptional regulator ShvR and its regulatory target afc are essential for the switch from persistent to acute infection by B. cenocepacia K56-2 in zebrafish embryos. This proof of principle shows the feasibility of identifying bacterial factors important for virulence of intracellular bacteria in zebrafish larvae using transposon-based high throughput screens.B. cenocepacia H111 is closely related to strain K56-2, yet is less virulent in different animal models. We found that constitutive expression of shvR in B. cenocepacia H111 increased virulence in zebrafish larvae to almost K56-2 levels in an afc dependent manner, which strengthens the finding that AFC is a key factor in acute virulence of B. cenocepacia K56-2, and strengthens our hypothesis that differences in regulatory signals between strains may be a major reason for differences in pathogenicity.In a second objective, I further analysed the role of several established bacterial factors in virulence of B. cenocepacia K56-2 in zebrafish embryos. While MgtC slightly contributed to virulence only in older larvae, we found that the zinc metalloprotease zmpA mutant was significantly attenuated in virulence, as found in a rat model of chronic infection. Previous unpublished results obtained in the laboratory have shown that B. cenocepacia K56-2 triggers autophagy in macrophages of infected zebrafish larvae, visualized as labeling of bacteria containing vacuoles with Lc3-GFP. Although no significant differences in the increase of pro-inflammatory gene expression was found, I observed that fewer zmpA containing vacuoles in infected macrophages in vivo recruited Lc3 compared to phagosomes containing wildtype bacteria. Together the data suggest that ZmpA contributes to induction of autophagy and inflammation in infected macrophages in zebrafish. Further research is needed to determine the correlation between bacterial factors, the engagement of the autophagy machinery and the extent of pro-inflammatory responses, which may lead to the discovery of new therapeutic targets against these important opportunistic pathogens.


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