Etude des causes et des conséquences du stress réplicatif endogène chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Causes and consequences of endogenous replication stress in budding yeast Saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : Romain Forey
• Direction : Philippe Pasero
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 15/11/2019
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de génétique humaine (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Michelle Debatisse
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Pasero, Michelle Debatisse, Constance Alabert, Sarah Lambert, Vincent Geli, Dominique Helminger, Benjamin Pardo
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Constance Alabert, Sarah Lambert

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcription génétique

Saccharomyces cerevisiae

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Replication

Checkpoint

Dntp

Transcription

Résumé

La transmission de l’information génétique au cours des divisions cellulaires dépend de la duplication de l’intégralité du génome suivant un processus appelé réplication de l’ADN. La réplication démarre au niveau de multiples origines (ORIs) réparties sur l’ensemble du génome, qui s’activent séquentiellement au cours de la phase S suivant un programme de réplication bien défini. Cette activation consiste en l’assemblage puis la progression de complexes protéiques appelés réplisomes au niveau des fourches de réplication. La progression des fourches de réplication est impactée par divers facteurs, suivant un processus communément appelé stress réplicatif. Les fourches de réplication bloquées sont des structures fragiles et la protection de leur intégrité est essentielle pour éviter la cassure de la molécule d’ADN et l’apparition d’instabilité génomique. La cellule contrôle le stress réplicatif par l’activation d’une voie de signalisation communément appelé le checkpoint de réplication, qui coordonne la réplication avec la réparation de l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire. Le checkpoint de réplication signale les fourches de réplication bloquées en partant de l’activation de la kinase Mec1ATR pour aboutir à l’activation de la protéine effectrice principale du checkpoint : la kinase Rad53CHK1. Une fois activée, Rad53CHK1 inhibe les origines de réplication normalement activées en fin de phase S (origines tardives) afin de limiter le stress réplicatif au niveau des fourches déjà activées. Rad53CHK1 permet aussi l’arrêt du cycle cellulaire et le maintien de l’intégrité des fourches bloquées. Enfin, Rad53CHK1 active la transcription de gènes nécessaires à la réparation des dommages de l’ADN ainsi que ceux nécessaires à la production des dNTPs. Plusieurs études menées chez S. cerevisiae et dans les modèles de mammifères indiquent que le checkpoint de réplication est actif au cours d’une phase S normale et suggèrent donc la présence d’un stress réplicatif endogène. Néanmoins aucune de ces études ne décrivent la source de ce stress réplicatif. Le but de mon projet de thèse a été de caractériser ce stress réplicatif endogène et d’identifier son(ses) origine(s). Nos résultats montrent que le checkpoint de réplication est activé transitoirement en début de phase S, à proximité des origines de réplication les plus précoces. Etant donné que cette activation a lieu en l’absence de stress exogène, elle confirme la présence d’un stress réplicatif endogène. Cette activation du checkpoint de réplication lors d’une phase S normale répond à l’épuisement des dNTPs cellulaires initialement présents en phase G1. Une fois activé, le checkpoint permet d’induire la synthèse de dNTPs nécessaire à la réplication complète du génome. Mais aussi de réguler le programme de réplication et permet le maintien de l’intégrité des fourches de réplication.L’ensemble de mes résultats montrent qu’au début d’une phase S normale, le checkpoint de réplication est activé de manière transitoire à proximité des origines précoces de réplication. Nous avons identifié l’épuisement du stock de dNTPs comme une des causes endogènes de l’activation du checkpoint. Ce dernier répond à un arrêt transitoire des fourches de réplication et permet d’induire la synthèse de nouveaux dNTPs, de réguler le programme de réplication et d’assurer la stabilité des fourches pendant l’arrêt. Ce travail met en évidence pour la première fois un rôle du checkpoint de phase S en absence de stress exogène, ce qui représente une avancée majeure dans le domaine.

During cell division, the duplication of the entire genome by the DNA replication process ensures the transfer of genetic information. DNA replication starts at multiple origins distributed all along the genome, sequentially activating during S phase following a well-defined replication program. This activation involves the assembly followed by the progression of protein complexes called replisomes at replication forks. Replication fork progression is disturbed by different factors, creating replication stress. Stalled replication forks are fragile structures. Protecting their integrity is crucial to avoid breaking the DNA molecule and creating genome instability. Cells control replication stress by activating a signalling pathway commonly referred to as the replication checkpoint. This checkpoint synchronizes DNA replication with DNA repair and cell cycle progression. It signals stalled replication forks, starting from the activation of the Mec1ATR kinase to end at the activation of the main effector protein : the Rad53CHK1kinase. Once activated, Rad53CHK1 inhibits the activation of replication origins usually activated at the end of S phase (late origins) in order to restrict replication stress at forks that are already activated. Rad53CHK1 also allows for the arrest of the cell cycle and the maintenance of stalled fork integrity. Lastly, Rad53CHK1 activates the transcription of genes needed to repair DNA damages as well as genes required for dNTP production. Several studies conducted with S. cerevisiae and mammalian models indicate that the replication checkpoint is activated during a normal S phase, suggesting the existence of endogenous replication stress. None of these studies however describes the source of this replication stress. The aim of my PhD was to characterise this endogenous replication stress and to identify its origin. Our results show that the replication checkpoint is temporarily activated at the beginning of S phase near early replication origins. Since this activation happens without any exogenous stress, this result confirms the existence of an endogenous replication stress. We found that this checkpoint activation during a normal S phase is triggered by the exhaustion of intracellular dNTP pools initially produced in G1. Once activated, the checkpoint allows for the synthesis of the dNTP pools required to fully replicate the genome. It also supports the replication program and the maintenance of the integrity of replication forks.Altogether, our results demonstrate that at the beginning of a normal S phase, the checkpoint is transiently activated near early replication origins. We identified the exhaustion of dNTP pools as one of the endogenous sources of the activation of the replication checkpoint. This activation is triggered by a transient arrest of replication forks. It allows for de novo dNTP synthesis, the regulation of the replication program and ensures fork stability during their blockage. This study demonstrates for the first time a role for the S phase checkpoint without any addition of exogenous stress, which is a major finding in the field.