Exploration du potentiel des vésicules extracellulaires en tant que vecteurs de protéines thérapeutiques

Exploring the potential of extracellular vesicles as therapeutic protein delivery vectors

• Auteur / Autrice : Sarah Le Saux
• Direction : Philippe Legrand, Marie Morille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 08/11/2019
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Charles Gerhardt (Montpellier ; 2006-....)
• Jury : Président / Présidente : Pierre Martineau
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Legrand, Marie Morille, Pierre Martineau, Claudia Montero-Menei, Juliette Vergnaud-Gauduchon, Guillaume Van Niel
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Claudia Montero-Menei, Juliette Vergnaud-Gauduchon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticorps

Endocytose

Vésicules extracellulaires

Mots clés libres

Vésicules extracellulaires

Délivrance intracellulaire

Modifications post-Production

Conservation

Voie d'endocytose

Anticorps

Extracellular vesicles

Intracellular delivery

Post-Production modifications

Storage

Endocytic pathway

Antibody

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nano-vésicules produites par les cellules : elles jouent un rôle clé dans la communication intercellulaire en délivrant des molécules, acides nucléiques et protéines. Grâce à ces propriétés naturelles, les VE ont émergé en tant que nouveaux vecteurs. La délivrance intracellulaire de protéines est particulièrement difficile, et les systèmes existants présentent des défauts (biocompatibilité, sûreté) : les VE pourraient être des candidats singulièrement intéressants. Mon objectif de thèse était d’évaluer le potentiel des VE pour la délivrance intracellulaire de fragment d’anticorps, en utilisant des processus de chargement physico-chimiques sur des VE après production. Le premier objectif était de produire, caractériser et conserver les VE. Les VE ont été isolés à partir de cellules souches mésenchymateuses murines par ultracentrifugation. Ils ont été caractérisés de façon exhaustive : les VE étaient sphériques, de 94±10 nm de diamètre, possédaient des protéines (TSG101, CD81) et des lipides (cholestérol, sphingomyélines, céramides) spécifiques de VE de petite taille. Les VE étaient davantage internalisés que les liposomes (standards, HSPC/Cholestérol) in vitro et ils suivent des voies d’endocytose différentes. Congeler les VE dans du trehalose (25 mM) avec inhibiteurs de protéase assurait une conservation optimale. Le deuxième objectif était d’utiliser des processus physico-chimiques pour charger dans les VE un fragment d’anticorps single-chain variable (scFv) avec un tag GFP et ciblant la tubuline humaine, et de parvenir à délivrer un scFv fonctionnel en intracellulaire. Différentes méthodes ont été évaluées : extrusion, sonication avec une sonde, bain à ultrasons, lyophilisation, cycles de congélation/décongélation, et des combinaisons de ces méthodes. Nous avons identifié des protocoles de chargement résultant en des pertes de VE et scFv inférieures à 20%. Pour certains procédés combinatoires, un léger marquage tubuline a été observé in vitro, ce qui implique que les complexes VE-scFv ont été internalisés, ont échappé à la dégradation endosomale et ont atteint la tubuline dans le cytoplasme. Ces résultats devront être confirmés, mais nous concluons que les VE semblent prometteurs en tant que système pour la délivrance intracellulaire d’anticorps fonctionnels, ce qui n’a jamais été décrit auparavant.

Extracellular vesicles (EVs) are nano-vesicles produced by cells: they play a key role in intercellular communication by delivering molecules, nucleic acids or proteins. Because of these natural features, EVs have emerged as novel vectors. Intracellular protein delivery is particularly challenging, and existing systems have shortcomings (biocompatibility, safety): EVs could be an especially interesting candidate. My objective for this PhD was to evaluate the potential of EVs for antibody fragment intracellular delivery, using physico-chemical loading processes on EVs once isolated. The first goal was to isolate, characterise and store nanosized EVs. EVs were isolated from murine mesenchymal stem cells by ultracentrifugation. They were thoroughly characterized: EVs were spherical, 94±10 nm, possessed proteins (TSG101, CD81) and lipids (cholesterol, sphingomyelins, ceramides) specific of small EVs. EVs were internalised to a greater extent than their liposomal counterparts (HSPC/Cholesterol standards) in vitro and follow different endocytic routes. Freezing EVs at -80°C in trehalose 25 mM with protease inhibitors ensured optimal EV storage. The second goal was to use physico-chemical processes to load EVs with an anti-tubulin GFP-tagged single-chain antibody fragment (scFv) and achieve intracellular delivery of functional scFv. Different methods were evaluated: extrusion, probe sonication, bath sonication, freeze drying, freeze-thaw cycles and combinations of these methods. We identified loading protocols leading to less than 20% loss of EVs and scFv. For some combinatory processes, a slight tubulin staining was observed in vitro, implying scFv-EV complexes were internalised, escaped from endosomes and reached tubulin in the cytoplasm. These results will need to be confirmed, but we conclude EVs show promise for the intracellular delivery of functional antibody, which has never been described before.