Thèse soutenue

Exploration du potentiel des vésicules extracellulaires en tant que vecteurs de protéines thérapeutiques
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Auteur / Autrice : Sarah Le Saux
Direction : Philippe LegrandMarie Morille
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie Santé
Date : Soutenance le 08/11/2019
Etablissement(s) : Montpellier
Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Charles Gerhardt (Montpellier ; 2006-....)
Jury : Président / Présidente : Pierre Martineau
Examinateurs / Examinatrices : Philippe Legrand, Marie Morille, Pierre Martineau, Claudia Montero-Menei, Juliette Vergnaud-Gauduchon, Guillaume Van Niel
Rapporteurs / Rapporteuses : Claudia Montero-Menei, Juliette Vergnaud-Gauduchon

Résumé

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Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nano-vésicules produites par les cellules : elles jouent un rôle clé dans la communication intercellulaire en délivrant des molécules, acides nucléiques et protéines. Grâce à ces propriétés naturelles, les VE ont émergé en tant que nouveaux vecteurs. La délivrance intracellulaire de protéines est particulièrement difficile, et les systèmes existants présentent des défauts (biocompatibilité, sûreté) : les VE pourraient être des candidats singulièrement intéressants. Mon objectif de thèse était d’évaluer le potentiel des VE pour la délivrance intracellulaire de fragment d’anticorps, en utilisant des processus de chargement physico-chimiques sur des VE après production. Le premier objectif était de produire, caractériser et conserver les VE. Les VE ont été isolés à partir de cellules souches mésenchymateuses murines par ultracentrifugation. Ils ont été caractérisés de façon exhaustive : les VE étaient sphériques, de 94±10 nm de diamètre, possédaient des protéines (TSG101, CD81) et des lipides (cholestérol, sphingomyélines, céramides) spécifiques de VE de petite taille. Les VE étaient davantage internalisés que les liposomes (standards, HSPC/Cholestérol) in vitro et ils suivent des voies d’endocytose différentes. Congeler les VE dans du trehalose (25 mM) avec inhibiteurs de protéase assurait une conservation optimale. Le deuxième objectif était d’utiliser des processus physico-chimiques pour charger dans les VE un fragment d’anticorps single-chain variable (scFv) avec un tag GFP et ciblant la tubuline humaine, et de parvenir à délivrer un scFv fonctionnel en intracellulaire. Différentes méthodes ont été évaluées : extrusion, sonication avec une sonde, bain à ultrasons, lyophilisation, cycles de congélation/décongélation, et des combinaisons de ces méthodes. Nous avons identifié des protocoles de chargement résultant en des pertes de VE et scFv inférieures à 20%. Pour certains procédés combinatoires, un léger marquage tubuline a été observé in vitro, ce qui implique que les complexes VE-scFv ont été internalisés, ont échappé à la dégradation endosomale et ont atteint la tubuline dans le cytoplasme. Ces résultats devront être confirmés, mais nous concluons que les VE semblent prometteurs en tant que système pour la délivrance intracellulaire d’anticorps fonctionnels, ce qui n’a jamais été décrit auparavant.