Développement d'un biosenseur fluorescent d'un mutant de p53 sujet à l'agrégation dans les cancers

Development of fluorescent biosensors for detection of agrgregation-prone mutant of p53 in human cancers

• Auteur / Autrice : Morgan Pellerano
• Direction : May Catherine Morris
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 26/11/2019
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Biomolécules Max Mousseron (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Pierre Roux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : May Catherine Morris, Loïc Blum, Marie Erard
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Loïc Blum, Marie Erard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines mutantes

Cancer

Protéines p53

Mots clés libres

Mutant de p53

Biosenseur fluorescent

Cancer

Agrégation

P53 mutant

Fluorescent biosensor

Cancer

Aggregation

Résumé

P53 est un suppresseur de tumeur qui joue un rôle clé dans la régulation de la transcription, la réparation de l'ADN, l'instabilité génétique, la sénescence, la régulation du cycle cellulaire et l'apoptose. Cette protéine, normalement nucléaire, se lie à l’ADN et régule la transactivation. Cependant, elle est souvent mutée dans les tumeurs humaines, entraînant une inactivation fonctionnelle et une prédisposition au cancer. Les mutants p53 se peuvent-être de deux catégories des mutants de « contact » ou « conformationnel ». Ces derniers entraînant des changements de conformation pouvant induire une agrégation de la protéine de type amyloïde. Des études récentes ont montré que l’agrégation de p53 pouvait être efficacement reversée, rétablissant ainsi la fonction de p53 chez la souris. Les approches de diagnostic actuelles basées sur le séquençage génétique permettent d'identifier le statut mutationnel de p53, mais ne renseignent pas sur son statut conformationnel. Le but de ma thèse est de développer un biosenseur peptidique fluorescent qui reconnaît et rend compte des mutants conformationnels de p53 exprimés dans des cancers humains. Nous avons caractérisé et optimisé la réponse de ce biosenseur par conjugaison avec différentes sondes sensibles à l'environnement. Nous avons également étudié leur capacité à signaler de manière sélective le mutant R248Q de p53 in vitro à l’aide de formes recombinantes de protéines p53 de type sauvage et mutantes, ainsi que de lysats de lignées cellulaires de cancer du poumon exprimant p53 de type sauvage (A549), le mutant R248Q (PC9) ou p53 - / - (H1299). Après avoir établi les conditions de travail optimales et les limites du biocapteur in vitro, nous avons appliqué ce biosenseur à l’imagerie de cellules vivantes par microscopie à fluorescence, après avoir procédé à l’internalisation cellulaire facilitée par un peptide vecteur (ou CPP : Cell Penetrating Peptide) afin d’établir son potentiel pour de futures applications de diagnostic et thérapeutiques. Nous avons de plus vérifié la réponse du biosenseur à l'expression induite de mutants conformationnels de p53, ainsi qu'à sa régulation négative, à la fois in vitro et dans des cellules vivantes.

P53 is a tumour suppressor that plays a key role in transcriptional regulation, DNA repair, genetic instability, senescence, cell cycle regulation and apoptosis. This normally nuclear protein tetramerizes to bind DNA and regulate transactivation. However it is often mutated in human tumours, leading to functional inactivation and predisposing to cancer. p53 mutants are distinguished as “contact” or “structural”, the latter resulting in conformational changes which may induce amyloid-like protein aggregation. Recent studies have shown p53 aggregation may be effectively reversed thereby restoring p53 function in mice. Current diagnostic approaches based on genetic sequencing allow to identify the mutational status of p53, but do not inform on its conformational status. The aim of my thesis is to develop a fluorescent peptide biosensor that recognizes and reports on conformational mutants of p53 expressed in human cancers. We have characterized and optimized the response of this biosensor through conjugation to different environmentally-sensitive probes. We have further investigated their ability to report selectively on the R248Q mutant of p53 in vitro using recombinant forms of wildtype and mutant p53 proteins as well as lysates from lung cancer cell lines that express wild-type p53 (A549), the R248Q mutant (PC9), or p53 - / - (H1299). Having established the optimal working conditions and limitations of the biosensor in vitro, we applied this biosensor to image living cells by fluorescence microscopy, following facilitated cellular internalization by a cell-penetrating peptide, so as to establish its potential for therapeutic perspectives. We are further monitoring response of the biosensor to induced expression of conformational mutants of p53, as well as to its downregulation, both in vitro and in living cells.