Thèse soutenue

Développement d’une nouvelle approche de criblage et de caractérisation d’interactions ligand-protéine membranaire par chromatographie de faible affinité miniaturisée

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Auteur / Autrice : Lucile Lecas
Direction : Claire Demesmay-GuilhinVincent Dugas
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie analytique
Date : Soutenance le 13/12/2019
Etablissement(s) : Lyon
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Chimie (Lyon ; 2004-....)
Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
Laboratoire : Institut des Sciences Analytiques
Jury : Président / Présidente : Jérôme Lemoine
Examinateurs / Examinatrices : Claire Demesmay-Guilhin, Vincent Dugas, Catherine Perrin
Rapporteurs / Rapporteuses : Valérie Pichon-Comparot, Eric Peyrin

Résumé

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Le Fragment-Based Drug Discovery consiste à développer de nouveaux médicaments à partir de fragments (petites molécules organiques de faible affinité pour une cible thérapeutique) et requiert des méthodes de criblage capables de détecter de faibles affinités (μM-mM). Récemment, la Chromatographie de Faible Affinité s’est avérée être une alternative intéressante aux méthodes de criblage de référence et consiste à immobiliser la protéine cible sur un support chromatographique puis à mesurer la rétention des fragments, directement liée à leur affinité pour la cible. Pour limiter au maximum la consommation en protéine et permettre l’étude de cibles difficiles à produire, nous avons décidé de développer cette approche à échelle miniaturisée. En pratique, un monolithe est synthétisé in-situ dans un capillaire de 75 µm et la protéine est également greffée in-situ. Les colonnes sont évaluées par analyse frontale avec des ligands d’affinité connue pour une protéine modèle. Parmi les différentes combinaisons testées, les meilleurs résultats ont été obtenus avec un monolithe organique fonctionnalisé streptavidine, permettant l’immobilisation rapide de la protéine cible biotinylée (interaction streptavidine-biotine). Nous avons alors travaillé sur une protéine membranaire, le récepteur A2A de l’adénosine, inséré dans un nanodisque biotinylé puis greffé sur des colonnes streptavidine en consommant moins d’1 µg de protéine/colonne. Des affinités jusqu’à quelques centaines de µM ont pu être détectées et quantifiées, confirmant l’activité de la protéine après immobilisation. L’identification de ligands parmi des fragments a permis d’illustrer le potentiel de cette technique pour le FBDD