Impact de Coxsackievirus B4 sur les cellules

Impact of Coxsackievirus B4 on cells

• Auteur / Autrice : Antoine Bertin
• Direction : Didier Hober
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie
• Date : Soutenance le 16/10/2019
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École graduée Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Pathogenèse virale du diabète de type 1 (Lille) - Pathogenèse virale du diabète de type 1 - ULR 3610
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Djamel Drider
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gilles Duverlie, Maël Bessaud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Insuline

Cellules à insuline

Infections à virus coxsackie

Entérovirus humain B

Insuline

Cellules bêta

Infections à virus coxsackies

Virus coxsackies

Mots clés libres

Coxsackievirus B4

Infection persistante

Cellules pancréatiques

Insuline

Coxsackievirus B4

Persistent infection

Pancreatic cells

Insulin

Résumé

Coxsackievirus B4 (CV-B4) est un virus du genre Enterovirus et de la famille des Picornaviridae. Il s’agit d’un virus à réplication cytoplasmique. C’est un virus qui provoque un effet cytopathique apparaissant rapidement dans les cellules in vitro. Des travaux antérieurs de notre équipe ont démontré que CV-B4 E2 était capable de persister dans certaines lignées cellulaires pancréatiques et d’induire des modifications d’expression du gène PDX1. La persistance de CV-B4 E2 dans les cellules et ses conséquences peuvent jouer un rôle dans la pathogenèse du diabète de type 1 (DT1). Les objectifs de ce travail sont : i) d’étudier la persistance de CV-B4 E2 dans des modèles de cellules pancréatiques, et les conséquences de l’infection dans ces cellules et notamment en ce qui concerne la sécrétion d’insuline ii) d’étudier l’impact de l’infection à CV-B4 E2 sur l’expression d’une protéine de rétrovirus endogène, impliquée dans la pathogenèse du diabète de type 1, dans des macrophages et des cellules pancréatiques primaires humaines in vitro.Des cellules canalaires pancréatiques issues de donneurs en état de mort cérébrale ont été cultivées pendant 7 semaines. La différenciation en cellules productrices d’insuline formant des agrégats ressemblant à des îlots a été induite. Dans les cellules canalaires, CV-B4 E2 provoquait la mort des cellules en 48 heures dans 5 cultures sur 7. Dans les 2 autres, le virus a persisté pendant 29 jours sans provoquer la mort des cellules. Dans ces cellules la formation d’agrégats ressemblant à des îlots était inhibée ainsi que la sécrétion d’insuline.Des cellules β de rat (lignée INS1) ont été infectées par CV-B4 E2. Après une crise aiguë la culture s’est poursuivie sans effet cytopathique visible au microscope inversé. La quantité d’insuline présente dans le surnageant de culture n’était pas modifiée par l’infection. Par contre, une quantité plus importante de proinsuline a été retrouvée dans les surnageants des cultures infectées. La prohormone convertase 2 (PC2) est une enzyme impliquée dans la maturation de la proinsuline en insuline. L’expression de l’ARNm de cette protéine, étudiée par RT-PCR en temps réel, était inhibée dans les cultures infectées. Il a été observé que l’ADN des cellules infectées de manière persistante était hyperméthylé comparé aux contrôles. Le profil protéique des cellules β analysé par spectrométrie de masse SHOTGUNétait modifié. Nos travaux montrent que l’infection à CV-B4E2persistante a un impact sur les cellules β et notamment sur le métabolisme de l’insuline.Il a été rapporté une augmentation d’expression du gène HERV-W Env chez les patients avec un DT1.L’expression de ce gène a été recherchée dans des cultures de macrophages et de cellules pancréatiques canalaires primaires humains, infectées par CV-B4 E2. Des cellules mononucléées du sang périphérique de 14 donneurs, ont été cultivées en présence de M-CSF afin de les différencier en macrophages. Dans les cultures de macrophages de 6 d’entre eux, l’infection par CV-B4 a provoqué une expression accrue de l’ARNm d’HERV-W Env, mise en évidence par RT-PCR en temps réel. Des cellules canalaires obtenues à partir du pancréas de 5 individus en état de mort-cérébrale ont été infectées par CV-B4. Une expression accrue de l’ARNm d’HERV-W Env a été retrouvée dans les cultures de cellules canalaires pancréatiques de 4 d’entre eux. La protéine HERV-W Env a également était retrouvée en quantité plus abondante dans les cellules canalaires infectées que dans les cellules contrôles. Ces travaux montrent que l’infection par CV-B4 E2 de cellules canalaires pancréatiques et de macrophages active la transcription du rétrovirus endogène HERV-W.En conclusion, qu’elle soit aiguë ou persistante, l’infection à CV-B4 a un impact sur les cellules. Les modifications cellulaires provoquées par le virus peuvent jouer un rôle dans le développement de la pathogenèse du diabète de type 1.

Coxsackievirus B4 (CV-B4) is a virus from the genus Enterovirus and the family Picornaviridae. It replicates in the cytoplasm of infected cells, and causes a cytopathic effect that appears rapidlyinvitro. Previous work from our team demonstrated that CV-B4 E2 could persist in pancreatic cell lines and inhibit the expression of PDX1 gene. The persistence of CV-B4 E2 in these cells, and its consequences can be involved in the pathogenesis of Type 1 Diabetes (T1D).The aims of this work were : i) to study the persistence of CV-B4 E2 in pancreatic cells, and the consequences of this infection in these cells, particularly regarding insulin ii) to evaluate the impact of CV-B4 E2 infection on the expression of an endogenous retrovirus potentially involved in T1D, inmacrophages, and human primary pancreatic cells in vitro.Pancreatic ductal cells from brain dead donors have been cultured for 7 weeks. The differentiation of these cells into insulin producing cell aggregates that resemble islet cells has been induced. In ductal cells, CV-B4 E2 caused cell death in 48H in 5 cultures out of 7. In the other 2 cultures, the virus persisted up to 29 days without inducing cell death. In these cells, the formation of islet-like aggregates was inhibited, as well as insulin secretion.β-cells (INS1 cell line) were infected with CV-B4 E2. After an acute crisis, the culture continued without any cytopathic effect noticeable under an inverted microscope. The quantity of insulin in the supernatant of the culture was not modified by the infection. Yet, a higher quantity of proinsulin was detected in the supernatants of infected cultures. Pro-hormone convertase 2 (PC2) is an enzymeinvolved in the processing of proinsulin into insulin. ThemRNA level of this protein, analyzed with real-time RT-PCR, was inhibited in infected cultures. It was observed that DNA of persistently infected cells was hypermethylated compared to controls. The profile of proteins expressed by β cell analyzed by SHOTGUN mass spectrometry was modified. Our work shows that persistent CV-B4 E2infection has an impact on β cells, especially on insulin metabolism.An increase in the expression of HERV-W Env gene has been reported in patients with T1D. The expression of this gene has been investigated in primary human macrophages and pancreatic ductal cells, infected with CV-B4 E2. Peripheral blood mononuclear cells have been extracted from 14donors, and cultured with M-CSF to differentiate them into macrophages. In 6 macrophage cultures,CV-B4 infection caused a raise in HERV-W Env mRNA level, as shown by real time RT-PCR. Pancreatic ductal cells, obtained from 5 brain dead donors, have been infected with CV-B4. An increased expression of HERV-W Env mRNA has been found in4 pancreatic ductal cultures. The protein HERV-WEnv has also been found in greater quantities in infected cells than in control cells. This work indicates that CV-B4 E2 infection of pancreatic ductal cells and macrophages activates the transcription of HERV-W Env.In conclusion, CV-B4 infection, whether it is acute or persistent, has an impact on pancreatic cells.The cellular modification brought by the virus can play a role in T1D pathogenesis.