Mise en place de contre-mesures pour limiter la perte protéique de cellules musculaires squelettiques consécutive à l’hypoxie cellulaire

Countermeasures to counteract the protein loss of skeletal muscle cells induced by hypoxia

• Auteur / Autrice : Samir Bensaid
• Direction : Claudine Fabre, Caroline Cieniewski-Bernard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences et techniques des activités physiques et sportives
• Date : Soutenance le 24/09/2019
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Recherche Pluridisciplinaire Sport, Santé, Société (Lille) - Unité de Recherche Pluridisciplinaire Sport, Santé, Société (URePSSS) - EA 7369

Mots clés

Mots clés contrôlés

Amyotrophie

Homéostasie protéique

Cellules satellites du muscle squelettique

Compléments alimentaires

Dissertation universitaire

Hypoxie cellulaire

Amyotrophie

Compléments alimentaires

Anoxie

Mots clés libres

Hypoxie

Réoxygénation

Stimulation mécanique

Supplémentation nutritionnelle

Cellule musculaire squelettique

Homéostasie protéique

Hypoxia

Reoxygenation

Mechanical stimulation

Nutritional supplementation

Skeletal muscle cell

Protein homeostasis

Résumé

Introduction et : ’exposition chronique à une hypoxie (diminution du taux d’oxygène) sévère engendre des effets délétères sur le système musculaire, entrainant des conséquences néfastes sur la masse musculaire squelettique. L'hypoxie provoque un déséquilibre de l'homéostasie protéique (balance entre anabolisme et catabolisme), en diminuant la synthèse des protéines (principalement régulée par la voie PI3K-Akt-mTOR) tout en augmentant la dégradation des protéines (principalement par autophagie et dégradation protéasomique). En revanche, les stimulations mécaniques (activité physique) et la supplémentation nutritionnelle, en particulier les acides aminés essentiel branché (BCAA), induisent l'activation de la voie mTOR tout en inhibant les voies cataboliques du muscles squelettiques chez l'homme, l’animal et cellules musculaires misent en culture. Sur un modèle in vitro de cellule musculaire squelettique, nous avons essayé de déterminer si la combinaison de la stimulation mécanique, la supplémentation nutritionnelle et une période de réoxygénation post-stimulation pourrait inverser les effets délétères de l'hypoxie sur l'homéostasie protéique.Protocole expérimentalPour vérifier notre hypothèse, nous avons utilisé un modèle de cellule musculaire squelettique en culture (C2C12). Après quatre jours de différenciation les myotubes C2C12 ont été placés dans une chambre hypoxique à 4% de O2 pendant 24h. Á la suite de cette période d’hypoxie, un programme de stimulation électrique a été appliquée aux cellules musculaires en utilisant un générateur d'impulsions électriques. Á la fin de la stimulation électrique, les myotubes ont tout d'abord été supplémentés avec des acides aminés essentiel branché (BCAA: mélange de leucine, d'isoleucine et de valine ajoutés à un milieu de culture), puis placés pendant 2 heures dans un environnement de normoxie (21% O2) (correspondant à la période de réoxygénation).RésultatsAprès 24 heures d'hypoxie, l'analyse morphologique des myotubes montre une diminution significative de leur diamètre, traduisant l'activation des voies de dégradation des protéines aux dépens des voies de synthèse des protéines. Appliqué séparément, chaque traitement a peu d’effet sur la voie mTOR et la morphologie des myotubes. Alors que, la combinaison de la stimulation électrique, de la supplémentation en BCAA et de la réoxygénation conduit à une augmentation de la phosphorylation de protéines clés impliquées dans la voie de synthèse des protéines (Akt, mTOR, p70S6K, GSK-3β), reflétant ainsi leur état d'activation. De plus, l'analyse morphologique montre une augmentation significative du diamètre du myotube et de l'indice de fusion (reflétant l'état de différenciation), signe de la présence d'une hypertrophie musculaire.ConclusionNos résultats suggèrent que la voie mTOR (l’une des voies principales de l’anabolisme) répond à une combinaison de stimulation électrique, de supplémentation en nutriments et de réoxygénation par phosphorylation de régulateurs clés de la synthèse des protéines, pouvant ainsi inverser la perte de protéines induite par l'hypoxie.

Background and aims : Chronic exposure to severe hypoxia has deleterious effects on the muscular system, in particular on skeletal muscle mass. Hypoxia leads to imbalance of protein homeostasis, decreasing protein synthesis (mainly regulated through PI3K-Akt-mTOR pathway) while increasing protein degradation (mainly through autophagy and proteasomal degradation). In contrast, mechanical stimuli and nutrients, particularly the branched-chain amino acids (BCAA), induce activation of the mTOR pathway in human and rat skeletal muscle as well as and in cultured muscle cells, and decrease protein catabolism. In a model of skeletal muscle cell culture, we attempt to determine whether the combination of mechanical stimulation, nutritional supplementation and reoxygenation could reverse the deleterious effects of hypoxia on protein homeostasis.Experimental methodsWe induced a hypoxic stress on skeletal muscle murine cells differentiated into myotubes C2C12: four days after differentiation, the C2C12 myotubes were placed into a hypoxic chamber at 4% O2 for 24h. Electrical stimulation was applied to the cells using a pulse generator to provide electric pulses. Following the ES treatment, myotubes were firstly supplemented with branched-chain amino acids (BCAA: mixture of leucine, isoleucine and valine added to culture media) while placed to normoxia during 2 hours (corresponding so to a reoxygenation protocol).ResultsAfter 24 hours of hypoxia, the morphological analysis of myotubes shows a significant decrease in their diameter, translating the activation of protein degradation pathways at the expense of protein synthesis pathways. When applied separately, each treatment has little effect on the mTOR pathway and morphology of myotubes. However, the combination of electrical stimulation, supplementation BCAA and reoxygenation lead to an increase of the phosphorylation of key proteins involved in protein synthesis pathway (Akt and p70S6 kinase), thus reflecting their activation state. In addition, morphological analysis shows a significant increase in myotube diameter and fusion index (reflecting the state of differentiation), a sign of the presence of muscle hypertrophy.ConclusionOur preliminary results suggested that mTOR pathway responds to a combination of electrostimulation, nutrient supplementation and reoxygenation by phosphorylation of key regulators of protein synthesis, and could reverse the protein loss induced by hypoxia.