Identification de nouveaux déterminants génétiques de la tolérance au gel chez Pisum sativum

Identification of new genetic determinants of frost tolerance in Pisum sativum

• Auteur / Autrice : Sana Beji
• Direction : Jean-Louis Hilbert, Bruno Delbreil
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie des Fonctions Biologiques
• Date : Soutenance le 05/03/2019
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la matière, du rayonnement et de l'environnement (Villeneuve d'Ascq, Nord)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Charles Viollette
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Institut national de la recherche agronomique (France ; 1946-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Banques de gènes

Gènes marqueurs

Liaison génétique

Recombinaison génétique

Étude d'association pangénomique

Locus à caractère quantitatif

Pisum sativum

Mots clés libres

Lignées isogènes proches

Résumé

Chez le pois (Pisum sativum L.) la tolérance au gel est contrôlée par un nombre relativement restreint de loci quantitatifs (QTL, Quantitative Trait loci) mis en évidence par analyse de liaison dans des populations biparentales de cartographie. Le développement récent de SNP en grand nombre et d'outils de génotypage à haut débit offre la possibilité d’approfondir les études du déterminisme génétique responsables de la variation phénotypique du caractère d’intérêt. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le déterminisme génétique de la tolérance au gel chez le pois par deux approches de génétique quantitative à savoir la cartographie de QTL par analyse de liaison, et la génétique d'association ou GWAS (Genome Wide Association Study). Une re-détection de QTL de tolérance au gel a été réalisée sur un sous-ensemble de 76 lignées recombinantes (RILs, Recombinant Inbred Lines) issues de la population Champagne x Térèse (Pop2,164 RILs) avec 6486 marqueurs. L’analyse a permis de préciser l'intervalle de confiance des QTL détectés précédemment et d’identifier des marqueurs utilisables pour la cartographie fine. Une cartographie fine de l’un des principaux QTL préalablement identifié (WFD6.1), a été réalisée en utilisant un matériel quasi-isogénique (NILs, Near Isogenic Lines) à ce QTL, dont la création par rétrocroisements assistés par marqueurs avait été préalablement initiée. Les NILs étudiées ont montré un faible taux de recombinaison au niveau du locus ciblé, ce qui a réduit la résolution de la cartographie fine. En parallèle, une analyse de génétique d’association, à partir d’une collection de 365 accessions de pois génotypés avec 11366 marqueurs SNP, a permis d’identifier 62 marqueurs en association significative avec la tolérance au gel. Ces résultats ont confirmé 3 QTL déjà détectés par analyse de liaison, dans de multiples environnements, sur les groupes de liaison (LG, Linkage Groups) III, V et VI. Ils ont également permis d'identifier un nouveau locus sur le LG II et deux loci sur les LGs I et VII, qui n'avaient auparavant été détectés que dans un seul environnement. De plus, nous avons identifié des haplotypes favorables à la tolérance au gel ainsi que les accessions représentatives de ces haplotypes. L’annotation des marqueurs candidats a permis d’identifier 50 gènes sous-jacents aux loci détectés par GWAS et ceux qui sont en déséquilibre de liaison fort (DL (r2) > 0.8) avec les marqueurs significatifs en GWAS. Parmi ces gènes, un CBF (C-repeat Binding Factor), situé sur le groupe de liaison VI au niveau du QTL WFD6.1 a été identifié. En nous basant sur la synténie avec Medicago truncatula, nous avons émis l’hypothèse qu’il existerait un cluster de gènes CBF à cet endroit. Par conséquent, nous avons construit deux banques BAC (Bacterial Artificial Chromosome) à partir de l'ADN de Champagne et Térèse qui présentent des niveaux contrastés de tolérance au gel. Ces banques ont été criblées par des marqueurs dessinés sur les séquences des gènes CBF repérées dans le génome de référence Caméor. Les clones BAC porteurs des marqueurs cibles ont été ensuite séquencées par la technologie de séquençage PacBio®. La caractérisation des séquences obtenues fait partie des perspectives de ce travail.

In pea (Pisum sativum L.), frost tolerance is controlled by a relatively small number of Quantitative Trait Loci (QTLs) identified by linkage analyses studies within biparental mapping populations. The recent discovery of high numbers of SNP and the development of high throughput genotyping tools offers the opportunity to further study the genetic determinism responsible for the phenotypic variation of the targeted trait. During this thesis, we investigated the genetic determinism of frost tolerance in pea by two quantitative genetic approaches namely linkage analysis QTL mapping and Genome Wide Association Study (GWAS). A re-detection of frost tolerance QTLs was performed on a subset of 76 recombinant inbred lines extracted from the Champagne x Térèse population (Pop2, 164 RILs) and genotyped with 6486 markers. The analyses allowed to refine the confidence intervals of previously detected QTLs and to identify markers to be used in a fine mapping approach. Fine mapping of one of the formerly identified QTLs (WFD6.1) has been carried out using NILs (Near Isogenic Lines) for the targeted QTL, which creation by marker-assisted backcrossing has previously been initiated. Studied NILs showed a low rate of recombination at the targeted locus, which reduced the resolution of fine mapping. Parallely, a genome wide association mapping, performed within a collection of 365 pea accessions genotyped with 11366 SNP markers, revealed 62 markers in significant association with frost tolerance. Results confirmed 3 QTLs already detected by linkage analyses studies on linkage groups (LGs) III, V and VI, in multiple environmental conditions. They also allowed to identify a new locus on LG II and two loci on LGs I and VII, which have formerly been detected in only one environment. In addition, GWAS allowed to identify favourable haplotypes for frost tolerance and representative accessions carrying these haplotypes. Annotation of candidate markers identified 50 genes underlying the GWAS-detected loci and markers in high linkage disequilibrium (LD (r2) > 0.8) with associated markers. Among these genes, a particular interest for a CBF gene (C-repeat binding factor), located on the linking group VI at a position corresponding to the WFD6.1 QTL, was mentioned. On the basis of the syntenic relationship with Medicago truncatula, we hypothesized the presence of a cluster of CBF genes at this position. Therefore, we constructed two BAC (Bacterial Artificial Chromosome) libraries from the DNA of Champagne and Térèse, characterized by contrasted levels of frost tolerance. These libraries were screened by markers designed from the sequences of the CBF genes identified from the reference genome of Caméor. BAC clones carrying targeted markers were then sequenced by the PacBio® sequencing technology. Further characterization of the obtained sequences obtained is part of the perspectives of this work.