Optimisation du métabolisme d'une souche d'Escherichia coli génétiquement modifiée pour la production de n-butanol à haut titre et rendement
Auteur / Autrice : | Antoine Boullet |
Direction : | Isabelle Meynial |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Ingenieries microbienne et enzymatique |
Date : | Soutenance le 06/12/2019 |
Etablissement(s) : | Toulouse, INSA |
Ecole(s) doctorale(s) : | École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse) |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI |
Jury : | Président / Présidente : Barbara Schoepp Cothenet |
Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Meynial, Béatrice Py, Fabien Pierrel, Henri-Pierre Fierobe, Philippe Soucaille | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Béatrice Py, Fabien Pierrel |
Mots clés
Résumé
Dans le cadre du développement durable, la production de n-butanol par voie biologique est une alternative écologique par rapport à sa synthèse par voie pétrochimique. Il existe des microorganismes naturellement capables de produire du butanol, tels que les Clostridiae, bactéries Gram positif, ayant une croissance strictement anaérobie. Ils produisent du butanol au travers d’une fermentation produisant un mélange d’acétone, de butanol et d’éthanol. La production de butanol en mélange avec d’autres molécules diminue le rendement de production en butanol et augmente le coût de purification. En 2015, l’équipe PEEP de TBI a construit une souche d’E. coli génétiquement modifiée exprimant la voie complète de conversion du pyruvate en n-butanol de C. acetobutylicum. Le métabolisme de cette souche a été conçu pour que les vitesses de croissance et de consommation du glucose soient couplées à la vitesse de production du butanol. En croissance en anaérobiose stricte en culture discontinue dans un milieu chimiquement défini à base de glucose supplémenté en extrait de levure (YE) et nitrate (NO3-), cette souche produit 3,3 g/L de butanol à un rendement de 0,23 g butanol /g glucose, en présence de coproduits minoritaires (succinate, lactate, acétate, butyrate). Ces coproduits diminuent le rendement de production en butanol et restent inattendus car les voies métaboliques correspondantes ont été supprimées. L’objectif de ce projet de thèse est d’identifier les voies métaboliques impliquées dans la production de ces coproduits et d’améliorer la compréhension du métabolisme de cette souche, afin de l’optimiser, d’augmenter le rendement butanol/glucose, et de simplifier le milieu de culture. Plusieurs pistes ont été envisagées : i) Expression de ferrédoxines NAD(P)+ oxydoréductases (FNOR) issues d’organismes autres que C. acetobutylicum dans l’objectif de coupler l’étape de réoxydation de la ferrédoxine réduite à la production d’ATP ; ii) Inactivation des voies métaboliques d’E. coli susceptibles d’être impliquées dans la synthèse des coproduits ; iii) Evolution adaptative in vivo de la souche, afin d’améliorer ses performances et accroitre sa tolérance au butanol dans le milieu supplémenté avec YE et NO3-, puis iv) Evolution adaptative in vivo de la souche dans le milieu sans supplémentation. Ces stratégies ont conduit à i) La construction d’une nouvelle souche d’E. coli dont la croissance anaérobie dépend de la fonctionnalité d’une FNOR : la FNOR de C. acetobutylicum, le complexe Rnf de C. ljungdahlii et la FNOR de C. tepidum ont été évaluées. Cette approche a conduit à la sélection d’un mutant de la FNOR de C. tepidum, ayant une activité ferrédoxine NAD+ réductase 2,2 fois supérieure à celle de l’enzyme native. Cette FNOR mutante a ensuite été exprimée dans la souche d’E. coli Butanol en remplacement de la FNOR de C. acetobutylicum. La caractérisation de son phénotype a montré sa capacité à produire 3 g/L de butanol à un rendement de 0,26 g/g ; ii) La délétion des gènes zwf et mdh dans la souche Butanol a permis d’augmenter le titre en butanol produit à 6 g/L et le rendement à 0,33 g/g ; iii) L’évolution adaptative in-vivo de la souche d’E. coli Butanol en culture continue, dans le milieu supplémenté avec YE et Ni, a conduit à la sélection d’une population évoluée produisant 11 g/L de butanol à un rendement de 0,34 g/g. Le séquençage complet des génomes de clones isolés à partir de cette population a conduit à l’identification de mutations dans deux gènes, yqhC et lptG, potentiellement impliquées dans les performances de la souche ; iv) L’évolution adaptative in-vivo de la souche Butanol dans le milieu sans supplémentation a conduit à la sélection de clones évolués produisant 2,5 g/L de butanol à un rendement de 0,28 g/g en culture discontinue. A notre connaissance, la production maximale de butanol reportée, couplée à la croissance anaérobie chez E. coli, ne dépasse pas 0,6 g/L, en milieu chimiquement défini à base uniquement de glucose.