Identification et caractérisation d'UGTs clés impliquées dans la biosynthèse des glycosides de stéviol chez Stevia rebaudiana

Identification and characterization of key UGTs involved in steviol glycoside biosynthesis in Stevia rebaudiana

• Auteur / Autrice : Eva Petit
• Direction : Jean Daydé, Alban Jacques
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Développement des Plantes
• Date : Soutenance le 19/04/2019
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Département Sciences agronomiques et agroalimentaires (Toulouse)
• Jury : Président / Présidente : Dominique Rolin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean Daydé, Alban Jacques, Monique Berger
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Danièle Reichhart, Harald Keller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Édulcorants

Enzymes

Mots clés libres

Stevia rebaudiana

Glycosides de stéviol

UDP-glycosyltransférase

Métabolisme secondaire

Glycosylation

UGT

Stevia rebaudiana

Steviol glycosides

UDP-glycosyltransferase

Secondary metabolism

Glycosylation

UGT

Résumé

Les glycosides de stéviol (SVglys) sont des métabolites secondaires végétaux présentant des propriétés édulcorantes intenses. Ils s’accumulent dans les feuilles de Stevia rebaudiana, où leur concentration peut atteindre jusqu’à environ 20% de la matière sèche. Ils comportent un noyau stéviol, issu de la voie des terpénoïdes, sur lequel sont greffées une ou plusieurs unités de sucre. Aujourd’hui, plus d’une trentaine de SVglys a été identifiée. Leur diversité et leur pouvoir sucrant provient de la position, de la nature et du nombre de sucres attachés. La glycosylation du noyau stéviol est médiée par une famille d’enzymes, les uridine-diphosphate glycosyltransférases (UGTs), qui catalysent le transfert d’un ou plusieurs sucres dits « activés » sur une gamme de molécules dites « acceptrices ». La glycosylation est ainsi l’une des réactions de modification les plus importantes vis-à-vis des métabolites secondaires. Bien que l’activité de nombreuses UGTs et de leurs produits soit connue depuis longtemps, seuls quelques gènes d’UGTs ont réellement été identifiés et fonctionnellement caractérisés. C’est le cas de la voie métabolique des SVglys, pour laquelle seulement quatre UGTs ont été caractérisées : UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1 et UGT73E1. L’objectif de ce travail de thèse était d’identifier de nouveaux gènes candidats pour les UGTs impliquées dans la biosynthèse des SVglys et de les caractériser fonctionnellement. Trois axes principaux ont été développés. Une première approche mendélienne a été conduite afin d’établir le déterminisme génétique des premières étapes de glycosylation de la voie des SVglys. Une approche gène-candidat a par la suite été développée pour identifier de nouvelles UGTs. Celle-ci combinait une démarche de sélection divergente entre deux groupes de plantes aux profils extrêmes en SVglys, à l’analyse du différentiel d’expression entre les transcriptomes de ces deux groupes. Plusieurs gènes candidats ont été trouvés, dont la fonction reste à vérifier. Pour cela, une méthode de caractérisation fonctionnelle des UGTs a finalement été développée. Ces enzymes étant régiospécifiques, elles ont la capacité de glycosyler de nombreux substrats in vitro, ce qui ne reflète pas forcément leur activité in vivo. Pour remédier à cela, la transformation transitoire de S. rebaudiana par agroinfiltration a été privilégiée, afin de caractériser la fonction d’UGTs dans des génotypes ne présentant pas l’activité recherchée. La transformation de S. rebaudiana n’étant pas aisée, la même méthode a été conduite chez Nicotiana benthamiana, pour lequel deux tests de screening d’activité efficaces ont été mis en place.

Steviol glycosides (SVglys) are plant secondary metabolites with intense sweetness properties. They accumulate in the leaves of Stevia rebaudiana, where their concentration can reach up to about 20% of the dry matter. They are composed of a steviol nucleus, derived from the terpenoid pathway, on which are grafted one or more sugar units. Today, more than thirty SVglys have been identified. Their diversity and their sweetening power come from the position, the nature and the number of sugars attached. Glycosylation of steviol is mediated by a family of enzymes, the uridine-diphosphate glycosyltransferases (UGTs), which transfer of one or more activated sugars to a range of acceptor molecules. Thus, glycosylation is one of the most important modification reactions towards secondary metabolites. Although the activity of many UGTs and their products is known for a long time, only few UGT’s genes have been identified and functionally characterized. This is notably the case of the SVglys pathway, for which only four UGTs have been characterized: UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1 and UGT73E1. The aim of this thesis was to identify new candidate genes for UGTs involved in SVglys biosynthesis and to characterize their function. Three main axes have been developed. A first approach, Mendelian, was conducted to establish the genetic determinism of the primary glycosylation steps of the SVglys pathway. A gene-candidate approach was subsequently developed to identify new UGTs. This one combined a divergent selection approach between two groups of plants with extreme profiles in SVglys, to the differential expression analysis between the transcriptomes of these groups. Several candidate genes were found, whose function stills left to be verified. For that, a method of functional characterization of UGTs was finally developed. Since these enzymes are regiospecific, they can glycosylate many substrates in vitro, which does not necessarily reflect their activity in vivo. To remedy this, the transient transformation of S. rebaudiana by agroinfiltration was favored, in order to characterize UGTs function in genotypes that do not exhibit the desired activity. As the transformation of S. rebaudiana is not easy, the same method was conducted at Nicotiana benthamiana, for which two effective activity screening tests were set up.