Caractérisation de l'arrêt de la gamétogenèse chez l'homme du gène à la protéine

Characterising human gametogenesis arrest from gene to protein

• Auteur / Autrice : Marie Christou-Kent
• Direction : Christophe Arnoult
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement - Oncogenèse
• Date : Soutenance le 21/11/2019
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Génétique, épigénétique et thérapies de l'infertilité (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Pierre Ray
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christophe Arnoult, Marie-Hélène Verlhac, Rémi Dumollard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Véronique Duranthon, Dominique Weil

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maturation ovocytaire in vitro

Gamétogenèse

Stérilité

Mots clés libres

Infertilité humaine

Ovogenèse

Spermatogenèse

Reproduction

Échec de maturation ovocytaire

Séquençage exomique

Human infertility

Oogenesis

Spermatogenesis

Reproduction

Oocyte meiotic deficiency

Exome sequencing

Résumé

L’infertilité est considérée comme une préoccupation majeure de santé, touchant à plus de 50 millions de couples mondialement. Les techniques actuelles d’Assistance Médicale à la Procréation (AMP) ont comme prérequis des gamètes aptes à la fécondation et au développement embryonnaire. Dans les rares cas où des anomalies génétiques mène à un arrêt de la gamétogenèse et donc à la production de gamètes immatures, défectueux ou dégradés, un traitement n’est pas possible. Afin d’envisager de nouvelles stratégies de traitement, il est nécessaire de comprendre les bases moléculaires de ce type d’infertilité. De plus, ces patients représentent une opportunité unique nous permettant de découvrir de nouveaux acteurs de l’ovogenèse et de la spermatogenèse ainsi que de déchiffrer les voies moléculaires impliquées dans la production de gamètes compétentes.L’analyse génétiques de cohortes de patients consanguins peut permettre l’identification de variants génétiques héritées comme causes possibles de la pathologie. Nous avons identifié, par séquençage exomique, un variant pathogène du gène PATL2 dans les patientes atteintes d’un échec de maturation ovocytaire. Cette pathologie, que nous avons appelé la Déficience Méiotique Ovocytaire (DMO), consiste en l’ovulation récurrent d’ovocytes immatures et non-fécondables. Le gène PATL2 code une ribonucléoprotéine ovocytaire qui a été impliqué dans la régulation de la traduction des ARNm maternelles chez l’amphibien. Sa fonction chez les mammifères était jusqu’à présent mal caractérisé. Nous avons aussi identifié un variant pathogène du gène SPINK2, codant un inhibiteur de protéases qui est important pour la neutralisation de l’acrosine pendant le développement de l’acrosome.Par la génération de lignées de souris déficientes (KO) pour les gènes Patl2 et Spink2, et d’une lignée PATL2 « étiquetée » par la méthode CRISPR-Cas9, nous avons montrés que les deux protéines correspondantes jouent des rôles indispensables dans leur gamétogénèses respectives. Nous avons démontré que Patl2 est fortement exprimé dans l’ovocyte murin en cours de croissance, et que son absence entraîne une dérégulation de nombreux transcrits essentiels pendant la phase de croissance, de maturation méiotique ou de développement pré-implantatoire. Les femelles PATL2 KO sont subfertiles par accouplement naturel, et lors de la stimulation hormonale produisent une grande proportion d’ovocytes sans globule polaire (immatures) et/ou avec des défauts au niveau du fuseau méiotique, mis en évidence par immunomarquage. Suite à la fécondation in vitro, un grand nombre d’ovocytes PATL2 KO ont répondu de manière aberrante à la fécondation. Concernant les mâles SPINK2 KO, nous avons montré que l’absence de la protéine SPINK2, qui se localise dans l’acrosome, entraîne un arrêt de la spermiogenèse et une azoospermie à cause d’une autophagie au stade spermatide-ronde. Cet effet est vraisemblablement dû à une activité aberrante de l’acrosine en absence de son inhibiteur, une hypothèse soutenue par la fragmentation de l’appareil de Golgi et l’absence de l’acrosome, événements observés par immunofluorescence.Nous avons, donc, caractérisé deux sous-types génétiques d’infertilité humaine associés à la mutation de ces deux gènes. Ce faisant, nous avons approfondi notre compréhension des fonctions respectives de ces acteurs clés de la gamétogenèse chez les mammifères, ce qui pourrait ouvrir la voie vers une amélioration des techniques d’AMP actuelles ainsi que le développement de thérapies alternatives et personnalisées.

Infertility is considered a global public health issue since it affects more than 50 million couples worldwide. Current assisted reproductive technologies (ARTs) have minimal requirements for gametes that are competent for fertilisation and subsequent embryo development. In cases where genetic abnormalities lead to arrested gametogenesis and the production of immature, defective or degraded gametes, treatment is not usually possible. Identifying the molecular causes of these types of infertility is crucial for developing new strategies to treat affected couples. Moreover, these patients represent a unique opportunity to discover new actors of oogenesis and spermatogenesis and to decipher the molecular pathways involved in the production of competent gametes.Genetic analysis of cohorts of infertile patients with shared ancestry can allow the identification of inherited genetic variants as possible causal factors. Using whole exome sequencing, we identified a homozygous pathogenic variant of the gene PATL2 in a cohort of patients with a phenotype of arrested oogenesis due to oocyte meiotic deficiency (OMD). OMD is a rare pathology characterised by the recurrent ovulation of immature oocytes. PATL2 encodes an oocyte ribonucleoprotein whose amphibian orthologue had been shown to be involved in oocyte translational control and whose function in mammals was poorly characterised. We also identified a pathogenic variant of the gene SPINK2 in a familial case of azoospermia. SPINK2 encodes a serine protease inhibitor essential for the neutralisation of acrosin activity during sperm acrosome formation.We showed, through generation of Patl2 and Spink2 knockout (KO) mice and Patl2 tagged mice (the latter using CRISPR-Cas9), that both corresponding proteins play essential respective roles in gametogenesis. We demonstrated that Patl2 is strongly expressed in growing mouse oocytes and that its absence leads to the dysregulation of numerous transcripts necessary for oocyte growth, meiotic maturation and preimplantation embryo development. This was accompanied by a phenotype of subfertility in KO females in natural mating, a large proportion of ovulated oocytes lacking a polar body (immature) and/or displaying spindle assembly defects in immunostaining, and high rate of oocytes with an aberrant response to fertilisation in IVF experiments. In Spink2 KO mice, we demonstrated that absence of Spink2 protein, which is located in the acrosome of maturing and mature spermatozoa, leads to arrested spermiogenesis and azoospermia due to autophagy at the round-spermatid stage. This is plausibly due to aberrant acrosin activity in the absence of its inhibitor, corroborated by fragmentation of the Golgi and absence of the acrosome in immunostaining.We have thus characterised two genetic subtypes of human infertility associated with mutation of these two genes. In doing so, we have furthered our understanding of the respective roles of these crucial actors of mammalian gametogenesis, potentially paving the way for improvement of current ARTs and development of new, personalised therapies.