Effectors of selectivity in laccase catalyzed reactions

par Lu Ren

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Thierry Tron et de Pierre Rousselot-Pailley.

Soutenue le 17-12-2019

à l'Ecole centrale de Marseille , dans le cadre de Ecole Doctorale Sciences Chimiques (Marseille) , en partenariat avec Institut des sciences moléculaires de Marseille (ISM2, UMR 7313) (laboratoire) , Institut des Sciences Moléculaires de Marseille / ISM2 (laboratoire) et de Institut des Sciences Moléculaires de Marseille / ISM2-AD2M - CNRS UMR 6263 (laboratoire) .

Le président du jury était Ling Peng.

Le jury était composé de Thierry Tron, Ling Peng, Belén Albela, Christine Cavazza.

Les rapporteurs étaient Belén Albela, Christine Cavazza.

  • Titre traduit

    Les effecteurs de la sélectivité dans les réactions catalysées par la laccase.


  • Résumé

    Les laccases sont des oxydases multi-cuivre produites par des champignons, des bactéries ainsi que des plantes et des insectes. Ces enzymes couplent la réduction du dioxygène à quatre électrons/quatre protons à l'oxydation de divers substrats, soit des molécules organiques, soit des ions métalliques. Largement utilisés dans diverses applications biotechnologiques pour leurs propriétés rédox, les laccases sont, en retour, peu sélectives en ce qui concerne l’oxydation de leurs substrats. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur les moyens d’apporter une certaine sélectivité dans les réactions catalysées par la laccase en utilisant des effecteurs. Une protéine dirigeante de plante (AtDIR6) a d'abord été étudiée comme modèle naturel. La DP AtDIR6 a la capacité de diriger la biosynthèse stéréosélective du (-) - pinorésinol à partir d'un monolignol. Ici, nous avons exploré la spécificité de substrat de AtDIR6 en utilisant des substrats analogues à l'alcool coniférylique avec des variations sur la chaîne allylique. La spectroscopie RPE a été utilisée pour sonder la stabilisation des radicaux par AtDIR6. Finalement, nous avons étudié la possibilité que le radical de l’alcool puisse former des adduits covalents avec AtDIR6. Nos résultats fournissent non seulement plus d'informations sur le mécanisme des DP, mais ouvrent également de nouvelles possibilités pour l'utilisation des DP dans le domaine de la chimie verte. Dans une seconde partie, des nanoparticules magnétiques (MNP) fonctionnalisées en surface ont été utilisées comme mimes bio-inspirés de DP. Deux variants de laccase offrant deux orientations opposées du site d'oxydation du substrat ont été immobilisées sur des MNP portant différents groupements fonctionnels (ex. un aldéhyde, un azide) à la surface des particules. L'activité des laccases orientées à la surface a été comparée à deux substrats modèles différents: l'ABTS et l'alcool coniférylique. A travers cette étude, nous apportons des preuves que l’activité d’une enzyme non sélective peut être fortement biaisée par le micro-environnement proposé autour de son site actif. Nos travaux peuvent constituer la base de nouvelles recherches visant à établir un système efficace d’oxydation contrôlées.


  • Résumé

    Laccases are multicopper oxidases produced by fungi, bacteria as well as plants and insects. These enzymes are coupling the neat four electrons/four protons reduction of dioxygen to the oxidation of various substrates, either organic or metal ions. Widely used in a variety of biotechnology applications for their redox properties, laccase are, in return, poorly selective as regards their substrates oxidation. In this study we focused on ways to bring some selectivity in laccase catalyzed reactions using effectors. A plant dirigent protein (AtDIR6) was studied first as a natural model. AtDIR6 has the ability to direct the stereoselective biosynthesis of the (−)-pinoresinol from a monolignol. Here, we explored the substrate specificity of AtDIR6 using substrates analogue to coniferyl alcohol with variations on the allylic chain. EPR spectroscopy was used to probe the stabilization of radicals by AtDIR6. Eventually, we studied the possibility of the coniferyl alcohol radical to from covalent adducts onto AtDIR6. Our results not only provide more insights into DP mechanism, but also open new possibilities for the application of DP in the field of green chemistry. In a second part, surface functionalized magnetic nanoparticles (MNPs) were used as bio-inspired mimics of DPs. Two laccase variants offering two opposite orientations of the substrate oxidation site were immobilized onto MNPs harboring different chemical functional groups (e.g. aldehyde, azide) at the particles surface. The activity of the surface oriented laccases was compared with two different model substrates: ABTS and coniferyl alcohol. Through this study we bring evidences that the activity of a non-selective enzyme can be substantially biased by the micro-environment proposed around its active site. Our work can be the basis for new researches to establish an efficient system for controlled oxiations.


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