Recherche & Développement de peptides chimériques impliqués dans l'axe hypothalamo-hypophysaires dans le but d'améliorer leur activité régulatrice de la prolifération cellulaire dans différentes conditions pathologiques

par Raffaello Paolini

Thèse de doctorat en Chimie - Cergy

Sous la direction de Anna Maria Papini et de Elisa Peroni.

Soutenue le 29-01-2019

à Cergy-Pontoise , dans le cadre de École doctorale Sciences et ingénierie , en partenariat avec Laboratoire de Chimie Biologique-LCB (Cergy-Pontoise, Val d'Oise) (laboratoire) .

Le jury était composé de Jean-Maurice Mallet, Francis Berenbaum, Anna Maria Papini rovero, Christelle Vêtu, Claude Carelli, Thierry Brigaud.

Les rapporteurs étaient Jean-Maurice Mallet, Francis Berenbaum.


  • Résumé

    L'ostéoarthrose est une maladie musculo-squelettique chronique caractérisée par une lésion de la matrice cartilagineuse. L‘insulin-like growth factor-1 (IGF-1) participe à la synthèse des composants de la matrice et exerce un effet régulateur sur les chondrocytes. De nouveaux peptides chimériques ont été conçues et développées en tant que molécules thérapeutiques ciblant les voies de l'IGF-1. Ces peptides sont impliqués dans la sécrétion d'hormones hypothalamo-hypophysaires afin d'optimiser leur activité régulatrice de la prolifération cellulaire et de favoriser la régénération du cartilage. Ils combinent une courte séquence d'acides aminés dérivée de l'hormone de croissance (GH) et un analogue de la somatostatine (SST-14). Ces séquences jouent sur la balance de la synthèse de l'IGF-I. De plus, une collection de cyclopeptides et de cyclopeptidomimétiques ayant des contraintes conformationelles a été conçue et synthétisée. La stratégie proposée est basé sur le remplacement des pi-stackings dans les peptides par la cyclisation d’une chaîne latérale à l'autre en introduisant des β-turn ou des structures α-hélicoïdale. L’objectif de ce projet était la synthèse de nouveaux peptides cycliques par l’introduction d’une cyclisation 1,2,3-triazolyle ou d’un lactame afin de stabiliser la conformation des structures α-hélicoïdale, de réduire la dégradation des peptides et maintenir ou améliorer leur activité biologique. La stabilité des peptides dans du liquide synovial de patients arthrosiques a été étudiée par HPLC en phase inverse, en appliquant une méthode permettant de discriminer les peptides parents de leurs produits de dégradation. La synthèse du peptide cyclique a été réalisée par la cyclisation intramoléculaire entre des chaînes latérales de deux acides aminés à différentes positions (i-i + y), déterminés non pertinents pour l'activité biologique mais fondamentals pour la stabilité de la conformation bioactive. L'activité in vitro a été étudiée sur différents types cellulaires chondrocytaires : cellules primaires provenant de cartilage du genou (NHAC-Kn), lignées de cellules articulaires costales immortalisées (C28I2) et chondrosarcome (SW1353). Les cellules ont été cultivées dans un milieu de croissance cellulaire avec ou sans peptide. La prolifération a été mesurée par incorporation de BrdU, la concentration totale en IGF-1R par ELISA et la redifférenciation ont été observées par microscopie après coloration au bleu alcian afin d’observer les composants de la matrice tels que les protéoglycanes. Les résultats in vitro ont présentés une diminution de la prolifération cellulaire pour les chondrocytes traités par les peptides. Ces cellules ont aussi présentés une augmentation de l'expression de l'IGF-1R et de la production de protéoglycanes. Les tests in vivo confirment l'effet de ces peptides. L'activité des peptides a été testée sur différents modèles animaux. Dans ces études chez l'animal, nous avons observé les effets thérapeutiques du peptide sur le cartilage et la modulation osseuse afin de démontrer sa capacité à préserver la structure du cartilage et, éventuellement, à limiter la formation d'ostéophytes. L'évaluation histologique quantitative a révélé que le groupe d’animaux ayant reçu le peptide gardaient une épaisseur de cartilage significativement supérieure aux contrôles et développaient moins d’ostéophytes. De plus, on observait une diminution significative de la taille et de la gravité des lésions. En agissant sur l’axe IGF-I, ces peptides ont stimulés la croissance des chondrocytes et pourraient être impliqués dans la synthèse et le maintien du tissu cartilagineux. De plus, le traitement par le peptide chez les animaux permettait, selon l’observation macroscopique, de ralentir la dégradation du cartilage de l’articulation. Globalement, ces résultats suggèrent que les peptides pourraient constituer un traitement efficace de la dégénérescence du cartilage articulaire.

  • Titre traduit

    Research & Development of chimeric peptides involved in the hypothalamic-pituitary axis to optimise their cell proliferation regulatory activity in different disease conditions.


  • Résumé

    Osteoarthritis (OA) is a chronic musculoskeletal disease characterized by matrix components degradation responsible for loss of cartilage. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) is a proliferative and a chondrogenic redifferentiative factor involved in the matrix components synthesis by regulating chondrocytes function. Since there is no curative treatment available for early and moderate OA, new innovative chimeric peptides was designed and developed as therapeutic molecules to target IGF-1 pathways. These peptides are involved in the hypothalamic-pituitary axis hormone secretion to optimize their cell proliferation regulatory activity and promoting cartilage regeneration. They combines a short amino acid sequence derived from growth hormone (GH) and an analogue of somatostatin (SST-14), which induce a balanced regulation of the synthesis of IGF-I and the expression of its receptor (IGF-IR). Moreover was also design and synthesis a conformationally constraint collection of cyclopeptides and cyclopeptidomimetics. The strategy followed during this research project is based on side-chain to side-chain cyclisation replacing pi-stackings in peptide to induce β-turn or α-helical structures. The goal of this work was the synthesis of new cyclic peptides by the introduction of 1,2,3-triazoly cyclization or lactam bridge to stabilize the α-helices conformation to reduce the peptides degradation, increase the stability of secondary structure and maintain or enhance the peptide activity in human culture cell. Furthermore we wanted to study the peptides stability in synovial fluid from OA patients by reverse-phase HPLC, applying a method allowing to discriminate the parent peptides from their degradation products. The synthesis of cyclic peptide was achieved by the intramolecular cyclisation between two amino acids side chains at different positions (i-i+y) determined irrelevant for the biological activity but fundamental for reproducing the bioactive conformation. The in vitro activity was study using different human chondrocyte cells, primary cells from knee cartilage (NHAC-Kn), immortalized articular cell lines (C28I2) and chondrosarcoma cell lines (SW1353). The cells were cultivated in cell growth medium with or without peptide. Proliferation was measured by BrdU incorporation, total IGF-1R concentration by ELISA and redifferentiation was observed by microscopy after alcian blue staining to observe matrix components such as proteoglycans. The in vitro models showed a decreased cell proliferation in chondrocytes treated with peptides, such cells also displayed an increase of IGF-1R expression and proteoglycans production. Indeed, the alcian blue staining, which allows the detection of proteoglycans, revealed an enhancement of both cell clusters and staining intensity indicating a role of peptides on chondrocytes redifferentiation. The In vivo experiment confirm the effect of this peptides.Peptides activity were tested in different animal model: Guinea pig for spontaneous OA AndNew-Zealand rabbits (ACLT) and rat model (ACLT and pMMx) for traumatic OA. In this animal study, we observed the effect of murine peptides on cartilage and bone modification to demonstrate their ability to preserve the cartilage structure and eventually reduce the osteophytes formation. The quantitative histologic evaluation revealed that the animal peptide injected group had a cartilage thickness significantly superior and decrease of osteophytes development. Moreover was observed significant decrease in both lesions size and severity. In conclusion theses peptides, by acting on IGF-I axis, improved the stimulation of chondrocyte cell growth and may be involved in the synthesis and maintenance of cartilage tissue. In addition, we observed a significant preservation of knee articulation macroscopic aspect in peptide treated animals. Altogether, these results suggest that peptides may be an effective treatment of early articular cartilage defects.



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