Biophysical characterization of aptamer-ligand interactions by native mass spectrometry

par Stefano Piccolo

Thèse de doctorat en Chimie Physique

Sous la direction de Valérie Gabelica.

Soutenue le 13-11-2019

à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde) , en partenariat avec Acides Nucléiques : Régulations Naturelle et Artificielle (laboratoire) .

Le président du jury était Caroline Tokarski.

Le jury était composé de Valérie Gabelica, Caroline Tokarski, Frank Sobott, Claudia Sisi, Sarah Sanglier.

Les rapporteurs étaient Frank Sobott, Claudia Sisi.

  • Titre traduit

    Caractérisation biophysique des complexes ARN-ligands par spectrométrie de masse native


  • Résumé

    Les aptamères sont des acides nucléiques capables de se lier sélectivement à un ligand ou à une famille de molécules. Les aptamères sont la partie sensible des riboswitches, qui sont des segments régulateurs de l'ARN messager impliqués dans l'expression génétique. Les aptamères ont aussi des applications prometteuses comme sondes artificielles et capteurs Pour ces technologies, il est crucial de comprendre comment la liaison se produit, de la quantifier, et de comprendre comment les changements conformationnels sont induits par les ligands. Les objectifs de cette thèse sont d'explorer l'applicabilité de la spectrometrie de mobilité ionique (IMS) couplée à la spectrométrie de masse (SM) native aux aptamères d'ADN et d'ARN, d'abord dans la quantification de liaison, ensuite dans la détection du changement conformationnel lors de la liaison du ligand.Dans la première partie, nous avons évalué la détermination des valeurs de constantes d’équilibre de dissociation (KD) par MS, en tenant compte des facteurs de réponse relatifs (Rx) des aptamères libres et liés. Les titrages en SM sont comparés, pour validation, avec la calorimétrie par titrage isotherme (ITC). Deux aptamères d'ARN sont pris comme modèles : l'aptamère du vert de malachite, largement étudié par ITC, et l'aptamère de la riboflavine mononucléotide , un cas réaliste d'ARN Mg2+-dépendant pour la liaison du ligand. Nous avons observé que l'acétate d'ammonium et l'acétate de triméthyl ammonium conviennent à l'étude des aptamères et leurs complexes, et que les valeurs de KD obtenues par ITC et SM native sont comparables. Les aptamères ARN de la néomycine et de la tobramycine ont été choisis pour tester la limite de détection en SM native. Nous concluons que la SM native est adaptée pour déterminer des valeurs de KD comprises entre 50 nM et 30 µM. La correction apportée par Rx est relativement modeste dans tous les cas, en suggerant que la liaison du ligand n'est pas associée à une différence conformationnelle significative lors de l'ionisation. Pour ces aptamères, nous concluons que l'hypothèse de Rx égaux est acceptable.Dans la deuxième partie, nous avons évalué si le mécanisme de "liaison adaptative" des aptamères peut être révélé par IMS. À cette fin, en plus des systèmes énumérés ci-dessus, nous avons étudié l'aptamère ARN de la tétracycline et une série d'aptamères ADN capables de lier la cocaïne, pour lesquels le changement conformationnel par liaison du ligand est largement documenté dans la littérature. Pour tous les aptamères à l'exception de l'aptamère de la tétracycline, nous n'avons pas observé de différences significatives dans la conformation en phase gazeuse des ions liés aux ligands ou Mg2+. Cependant, nous avons observé un changement significatif dans la mobilité des ions de l'aptamère de la tétracycline. Le Mg2+ (100 µM) s’avère essentiel pour la liaison du ligand. Pour la série des aptamères de la cocaïne, même si nous ayons observé dans des conditions douces de pré IMS des ions compacts aussi bien pour les aptamères libres que pour les aptamères liés, une extension conformationnelle est visible à haute activation pre-IMS, bien révélée par l'état de charge 7-, qui suggère des réarrangements de phase gazeuse. Pour mieux étudier ces réarrangements, nous avons modifié les séquences avec des extensions dA, afin de comparer des systèmes ayant un nombre similaire de degrés de liberté sans modifier la structure cœur. Nous proposons également de nouvelles façons de présenter ces données, mieux adaptées quand la dissociation du ligand, la perte d’aduits et le dépliement d’ion arrivent dans les mêmes gammes d’énergie. L'augmentation graduelle de l'activation collisionnelle avant l'IMS, a révélé que l’energie de dépliement est corrélée au contenu en paires de bases, ce qui suggère que les paires de bases sont conservées dans les structures en phase gazeuse. Nous avons également observé que le ligand se perd à des énergies inférieures à celles du dépliage.


  • Résumé

    Aptamers are single-stranded nucleic acids capable to bind selectively to a ligand or to a family of molecules. Aptamers are the sensing part of riboswitches, which are regulatory segments of messenger RNA involved in gene expression. Aptamers are also promising artificial probes, sensors and stimuli-responsive elements. In the development of aptamer-based technology, it is crucial to understand how binding is occurring, to quantify affinities, and ligand-induced conformational changes. The objective of this thesis is to explore the applicability of native IM-MS to DNA and RNA aptamers to quantify binding and to detect conformational change upon binding.In the first part, we evaluated the quantitative determination of equilibrium dissociation constants (KD) by mass spectrometry (MS), and the necessity of including a correction for relative response factors of free and bound aptamers. We compared isothermal titration calorimetry and MS titrations to validate the quantifications. Two RNA aptamers were taken as models: the malachite green aptamer, extensively studied by ITC, and the riboflavin mononucleotide aptamer, a case of Mg2+-dependent ligand binding. We observed that typical volatile electrolytes ammonium acetate and trimethyl ammonium acetate are suitable to study RNA aptamer binding, and that comparable KD values are obtained from ITC and native MS. The neomycin and tobramycin RNA aptamers were chosen to test the limit of detection of native MS. We found that native MS is appropriate to determine KD values in the range from 50 nM to 30 µM. The relative response factor correction was relatively modest in all cases, suggesting that the ligand binding is not associated to a significant conformational difference upon ionization. For these aptamers, we conclude that assuming equal response factors is acceptable.In the second part, we evaluated whether the aptamers’ “adaptive binding” mechanism can be revealed by ion mobility spectrometry (IMS). To this aim, in addition to the systems listed above we studied the tetracycline RNA aptamer and a series of cocaine-binding DNA aptamers, for which the conformational change upon binding is reported in literature. For all aptamers except the tetracycline aptamer, we did not observe a significant difference in the shape of the gas-phase structure upon ligand or Mg2+ binding. However, a significant change was observed in tetracycline RNA aptamer’s ion mobilities, at biologically relevant concentration of Mg2+ (100 µM), and we found that Mg2+ is essential for ligand binding, in agreement with previous solution studies. For the cocaine-binding DNA aptamer series, although we observed similar compactness for the free and bound aptamers in soft pre-IMS conditions, a conformational extension occurs at high pre-IMS activation, best revealed by charge state 7-, suggesting gas-phase rearrangements. To better investigate whether the energetics of these rearrangements depend on pre-folding or on ligand binding, we modified the sequences with dA overhangs, to compare systems with similar numbers of degrees of freedom without altering the core structure. We also propose new ways of presenting the data, adapted to the cases where ligand dissociation, declustering and unfolding occur at similar voltages. The gradual increase of the pre-IMS collisional activation revealed that the unfolding energetics is correlated with the base pairs content, suggesting that base pairs are conserved in the gas-phase structures. We also found that ligand is lost at lower energies than unfolding.In summary, gas-phase compaction occur for both the free aptamers and bound aptamers, and memories of the solution-phase structures can only be revealed in some particular cases. However, the compaction towards similar shapes might constitute an advantage for the quantification, because molecular systems of similar shapes have similar electrospray responses. Consequently, native MS provides reliable estimations of KD values.


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