Development of a test associated with magnetic nanoparticles for the diagnosis of tuberculosis.

par Nancy León janampa

Thèse de doctorat en Chimie Organique

Soutenue le 29-11-2019

à Bordeaux en cotutelle avec l'Universidad Peruana Cayetano Heredia , dans le cadre de École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde) , en partenariat avec Institut des Sciences Moléculaires (Bordeaux) (laboratoire) .

Le président du jury était Patrick Babin.

Le jury était composé de Magali Szlosek Pinaud, Pohl Luis MILON MAYER, Jorge Luis AREVALO ZELADA.

Les rapporteurs étaient Ana Cecilia VALDERRAMA NEGRON, Virginie Monnier.

  • Titre traduit

    Développement d'un test associé à des nanoparticules magnétiques pour le diagnostic de la tuberculose.


  • Résumé

    Mycobacterium tuberculosis provoque l'une des maladies qui présentent le taux de mortalité et de morbidité le plus élevé des Amériques et du monde. Dans les pays en développement, le diagnostic de la tuberculose (TB) repose sur la microscopie des frottis et des cultures bactériologiques. La première méthode a une faible sensibilité et la seconde met plusieurs semaines à atteindre un diagnostic de confirmation. L'absence de diagnostic rapide compromet les efforts de lutte contre la tuberculose, favorisant ainsi sa transmission à la population vulnérable. Actuellement, les nanoparticules magnétiques (MNP) fonctionnalisées par des biomolécules sont utilisées en biomédecine, en raison de leurs propriétés magnétiques, électriques et optiques. De cette manière, en appliquant des champs magnétiques externes, les MNP bio-fonctionnalisées sont utilisées pour détecter et concentrer les cellules et les biomolécules à partir d'échantillons biologiques.Dans ce travail, nous présentons la synthèse, la caractérisation et la bio-fonctionnalisation de nanoparticules magnétiques afin de développer un test ELISA en sandwich associé aux MNP, afin de détecter les antigènes de M. tuberculosis. À cette fin, des nanoparticules magnétiques ont été synthétisées par une méthode de co-précipitation. La surface des MNP a été amino-silanisée (MNP@Si@NH2) et caractérisée par des méthodes physico-chimiques.Les antigènes MTB évalués dans cette étude étaient: Hsp16.3, CFP10, ESAT6, MTC28, MPT64, protéine de 38 kDa, Ag85B et MoeX. Le clonage et l'expression de protéines recombinantes ont été réalisés dans le système de E. coli BL21 (DE3) pLysS. Des anticorps polyclonaux ont été produits chez des lapins Nouvelle-Zélande et des souris BALB/C, préalablement immunisés avec des antigènes recombinants purifiés. Des anticorps spécifiques (ab) ont été immobilisés sur les surfaces des MNP amino-silanisées. Les MNP@Si@ab ont été associées dans un test ELISA sandwich colorimétrique pour capturer et détecter les antigènes natifs du MTB à partir d’échantillons d’expectorations.La XRD, la spectroscopie Mössbauer, le potentiel zêta, la TEM et le FTIR ont validé l'obtention des MNP montrant un diamètre de cristal de diffraction de ~ 12,5 nm (10,48 ± 2,56 nm), une charge nette superficielle de +23,57 ± 2,87 mV, des profils caractéristiques de magnétite et une structure sphérique. De plus, une saturation en aimantation de 37,06 emu.g-1 a été observée. Pour la fonctionnalisation des surfaces de nanoparticules avec des anticorps, une méthode via l'utilisation d'ester activé (agent de couplage EDC/NHS) a été utilisée pour la formation de liaisons peptidiques. Des paramètres tels que le temps d'incubation, la concentration des agents de couplage et le niveau de saturation de surface des MNP amines silanisées (MNP@Si@NH2) ont déjà été standardisés.Enfin, des anticorps fonctionnalisés sur des MNP ont été utilisés pour capturer et détecter les antigènes recombinants et natifs de M. tuberculosis dans un test sandwich ELISA-MNP@Si@ab (dans un temps de réaction <4 h). Les antigènes ESAT6 et CFP10 ont été mieux différenciés dans les expectorations des patients atteints de tuberculose (fold value ~ 1,8). L'utilisation de MNP@Si@ab a amélioré la détection des antigènes du MTB dans des échantillons biologiques. Nos résultats sont encourageants, mais des évaluations supplémentaires sont nécessaire telles que la détermination de réactions croisées avec des échantillons d'expectorations provenant de patients atteints d'autres infections, la réalisation du test avec les expectorations fraîches de patients tuberculeux et la détermination de la sensibilité et de la spécificité de la méthode.


  • Résumé

    Mycobacterium tuberculosis causes one of the diseases with the highest mortality and morbidity rate in the Americas and around the world. In developing countries, the diagnosis of tuberculosis (TB) is based on smear microscopy and bacteriological cultures. The first method has low sensitivity, and the second take several weeks to reach a confirmatory diagnosis. The lack of a rapid diagnosis compromises the efforts to control TB, favoring its transmission to the susceptible population. Currently, magnetic nanoparticles (MNPs) functionalized with biomolecules have been used in biomedicine, due the magnetic, electrical and optical properties. In this way, applying external magnetic fields, bio-functionalized MNPs is used to detect and concentrate cells and biomolecules from biological samples.In this work we present the synthesis, characterization and bio-functionalization of magnetic nanoparticles, to develop a sandwich ELISA assay associated to MNPs to detect antigens from M. tuberculosis. For this purpose, magnetic nanoparticles were synthesized by co-precipitation method. The MNP surface was amine-silanized (MNP@Si@NH2) and characterized by physical-chemical methods.The MTB antigens evaluated in this study were: Hsp16.3, CFP10, ESAT6, MTC28, MPT64, 38 kDa protein, Ag85B and MoeX. Cloning ad expression of recombinant proteins were made in E. coli BL21 (DE3) pLysS system. Polyclonal antibodies were produced in New Zealand rabbits and BALB/C mice, previously immunized with purified recombinant antigens. Specific antibodies (ab) were immobilized in the amine-silanized MNP surfaces. The MNP@Si@ab were associated in a colorimetric sandwich ELISA assay to capture and detect native MTB antigens from sputum samples.The XRD, Mössbauer spectroscopy, zeta potential, TEM and FTIR demonstrated the successful preparation of the MNPs showing a diffraction crystal diameter of ~12.5 nm (10.48 ± 2.56 nm), superficial net charge of ᶎ: +23.57 ± 2.87 mV, characteristic patterns of magnetite and a spherical structure. Additionally, a magnetization saturation of 37.06 emu.g-1 was observed. For the functionalization of nanoparticle surfaces with antibodies, active ester method (coupling agent EDC/NHS) were used for peptide bond formation. Parameters such as time of incubation, concentration of coupling agents and surface saturation level of amine-silanized MNPs (MNP@Si@NH2), were previously standardized.Finally, antibody functionalized on MNPs were used to capture and detect recombinant and native M. tuberculosis antigens in an ELISA-MNP@Si@ab sandwich test (in a reaction time <4 h). The ESAT6 and CFP10 antigens were better discriminated in sputum pooles from patients with TB (fold value ~ 1.8). The use of MNP@Si@ab improved the detection of MTB antigens in biological samples. Our results are encouraging, but the essay requires additional evaluations such as determining cross-reactions with sputum samples from patients with other infections, performing the test with fresh sputum of TB patients, and determining the sensitivity and specificity of the method.


  • Résumé

    Mycobacterium tuberculosis causa una de las enfermedades con la tasa más alta de mortalidad y morbilidad en las Américas y en todo el mundo. En países en vías de desarrollo, el diagnóstico de tuberculosis (TB) se basa en microscopía de frotis y cultivos bacteriológicos. El primer método tiene baja sensibilidad y el segundo toma varias semanas para llegar a un diagnóstico confirmatorio. La falta de un diagnóstico rápido compromete los esfuerzos para controlar la TB, lo que favorece su transmisión a la población susceptible. Actualmente, las nanopartículas magnéticas (MNP) funcionalizadas con biomoléculas se han utilizado en biomedicina, debido a las propiedades magnéticas, eléctricas y ópticas. De esta manera, aplicando campos magnéticos externos, se utilizan MNP bio-funcionalizadas para detectar y concentrar células y biomoléculas a partir de muestras biológicas. En este trabajo presentamos la síntesis, caracterización y bio-funcionalización de las nanopartículas magnéticas para desarrollar un ensayo ELISA sándwich usando MNPs para detectar antígenos de M. tuberculosis. Para este propósito, las nanopartículas magnéticas fueron sintetizadas por el método de co-precipitación. La superficie de MNP fue amino-silanizada (MNP@Si@NH2) y se caracterizada por métodos físico y químicos. Los antígenos de MTB evaluados en este estudio fueron: Hsp16.3, CFP10, ESAT6, MTC28, MPT64, proteína de 38 kDa, Ag85B y MoeX. La clonación y la expresión de las proteínas recombinantes se realizaron en el sistema de E. coli BL21 (DE3) pLysS. Se produjeron anticuerpos policlonales en conejos de Nueva Zelanda y ratones BALB/C, inmunizados previamente con antígenos recombinantes purificados. Se inmovilizaron anticuerpos específicos (ab) en las superficies de MNP amino-silanizadas (MNP@Si@ab). El MNP@Si@ab fue utilizado en un ensayo ELISA sándwich colorimétrico para capturar y detectar antígenos de MTB nativos en muestras de esputo. La XRD, espectroscopia de Mössbauer, la potencial zeta, TEM y FTIR demostraron la preparación exitosa de los MNP, el cual mostró un diámetro de difracción del cristal de ~ 12.5 nm (10.48 ± 2.56 nm), carga neta superficial de ᶎ: +23.57 ± 2.87 mV, patrones característicos de magnetita y una estructura esférica. Además, una saturación de magnetización de 37.06 emu.g-1 fue observada. Para la funcionalización de superficies de nanopartículas con anticuerpos, se utilizó el método del éster activo para la formación de enlaces peptídicos. Parámetros tales como el tiempo de incubación, la concentración de los agentes de acoplamiento y el nivel de saturación de la superficie de las MNPs aminosilanizadas (MNP@Si@NH2) fueron estandarizadas. Finalmente, se usaron MNP funcionalizados con anticuerpos para capturar y detectar antígenos nativos y recombinantes de M. tuberculosis en una prueba sándwich de ELISA-MNP@Si@ab en un tiempo de reacción <4 h. Los antígenos ESAT6 y CFP10 se discriminaron mejor en las muestras de esputo de los pacientes con TB (fold value ~ 1,8). El uso de MNP@Si@ab mejoró la detección de antígenos de MTB en muestras biológicas con respecto a un sELISA convencional. Nuestros resultados son alentadores, pero el ensayo requiere evaluaciones adicionales, como determinar reacciones cruzadas con muestras de esputo de pacientes con otras infecciones, realizar la prueba con esputo frescos de pacientes con TB y determinar la sensibilidad y especificidad clînica del método


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