Le rôle de la signalisation calcique dans le Syndrome de l'X fragile

Dissecting the role of calcium signaling in Fragile X syndrome

• Auteur / Autrice : Sara Castagnola
• Direction : Barbara Bardoni
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions moléculaires et cellulaires
• Date : Soutenance le 28/06/2019
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire - Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université de Nice (1965-2019)
• Jury : Président / Présidente : Michèle Studer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michèle Studer, Nicoletta Landsberger, Séverine Massenet, Thomas Maurin, Alessandra Folci
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Nicoletta Landsberger, Séverine Massenet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interneurones

Troubles du spectre de l'autisme

Déficience intellectuelle

Syndrome de l'X fragile

Mots clés libres

Syndrome de l’X Fragile

Retard mental

Troubles du spectre de l’autisme

FMRP

Signalisation calcique

Cav2.1

Hétérogénéité

Interneurones

Agonist-induced Functional Analysis and Cell Sorting (aiFACS)

Fragile X syndrome

Intellectual disability

Autism spectrum disorder

FMRP

Calcium signaling

Cav2.1

Heterogeneity

Interneurons

Agonist-induced Functional Analysis and Cell Sorting (aiFACS)

Résumé

Le syndrome de l’X fragile (FXS) est la forme héréditaire la plus commune de retard mental (RM) et la première cause de troubles du spectre de l’autisme (TSA). Il est causé par la perte d’expression du gène FMR1 qui code la protéine Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP). FMRP est une protéine capable de se lier aux ARNs, et elle est impliquée dans différentes étapes du métabolisme de l’ARN allant du transport des ARNs au contrôle de la traduction des ARNm au niveau du soma et des synapses. Pour identifier les différents ARNm ciblés par FMRP, nous avons séquencé à haut-débit les ARNs isolés par « crosslinking » immunoprécipitation (HITS-CLIP ou CLIP-seq). Cette technique nous a permis d’identifier 1065 ARNm liés par FMRP avec une forte affinité. Un nombre remarquable de ces ARNm code des régulateurs de l’homéostasie ionique, et plus particulièrement l’homéostasie calcique. A partir de ces données, j’ai développé le premier axe de ma thèse, ciblé sur la compréhension de l’homéostasie du Ca2+ dans le FXS. Je me suis plus particulièrement focalisée sur l’une des cibles principales de FMRP, appelée Cacna1a. Ce gène code la sous-unité formant le pore du canal calcique voltage-dépendant de type P/Q (VGCC) Cav2.1, qui est localisé dans les neurones au niveau du compartiment somato-dendritique et de l’axone. Le canal Cav2.1 laisse entrer le calcium dans le cytosol des neurones lors de la dépolarisation de la membrane, et de nombreux changements intra-cellulaires découlent de cet influx de calcium, en particulier la libération de neurotransmetteurs et la transcription calcium-dépendante. Mon but était d’analyser la corrélation entre l’absence de FMRP et l’expression de Cacna1a dans des cultures primaires de neurones afin de déterminer le rôle de ce gène et de cette protéine dans la physiopathologie du FXS. Pour cela, j’ai réalisé une analyse fonctionnelle de la régulation calcique en utilisant une méthode d’imagerie calcique sur des neurones en culture Fmr1Knock-Out (KO) corticaux et hippocampaux. J’ai ainsi pu observer que ces neurones ont un influx de calcium plus faible et plus lent que les neurones sauvages (WT) en réponse à une dépolarisation KCldépendante. De plus, j’ai également montré que la protéine codée par Cacna1a a une activité et une synthèse réduite à la membrane plasmique des souris Fmr1-KO par rapport aux wild-type (WT). Mes résultats mettent donc en évidence un nouveau phénotype pour les neurones Fmr1-KO en culture et montrent que le défaut d’homéostasie calcique est un nouveau biomarqueur de ce modèle cellulaire. Dans le second axe de mon travail, j’ai étudié le rôle de l’homéostasie calcique dans les différentes populations cellulaires qui composent le cerveau en présence et en absence de FMRP. Pour mieux décrire la diversité des différents types cellulaires observés en imagerie calcique et définir quelles caractéristiques moléculaires appartiennent à chaque sous-groupe neuronal, j’ai développé un nouvel outil d’analyse appelé aiFACS pour «agonist-induced Functional Analysis and Cell Sorting». Cette technique permet de stimuler individuellement les neurones et d’analyser leur réponse à un agoniste pharmacologique et de les trier simultanément. Différentes analyses «-omics» permettent ensuite de définir l’identité des différentes cellules et les éléments moléculaires qui caractérisent la réponse des neurones WT par rapport aux Fmr1-KO. Grâce à cette méthode, j’ai mis en évidence une dérégulation de l’excitabilité des interneurones, ce qui permet de mieux caractériser le schéma chimique du cerveau de ces souris.

Fragile X Syndrome (FXS) is the most common form of inherited intellectual disability (ID) and the primary cause of autism spectrum disorder (ASD). It originates from the lack of expression of the Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) gene which encodes the Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP). FMRP is an RNA-binding protein involved in different steps of RNA metabolism, ranging from RNA transport to translational control of mRNAs at soma and at synapses. To identify the repertoire of mRNA targets of FMRP, we used the high-throughput sequencing of RNAs isolated by crosslinking immunoprecipitation (HITS-CLIP or CLIP-seq), resulting in the identification of 1065 mRNAs bound by FMRP with high affinity. Remarkably, a number of them encode regulators of ion homeostasis and, in particular, several calcium homeostasis players. I started from these findings to develop the first axis of my thesis focused on the understanding of Ca2+ homeostasis in FXS. In particular, I focused on one of the most enriched mRNA targets of FMRP, namely Cacna1a. This gene encodes the pore-forming subunit of the P/Q type Voltage-Gated Calcium Channel (VGCC) Cav2.1, which is particularly expressed in neurons, both in axon terminal and somatodendritic compartments. The Cav2.1 channel allows the entry of calcium in the cytosol of neurons upon membrane depolarization and several intracellular changes derive from this calcium influx, notably neurotransmitter release and calcium-dependent gene transcription. My goal was to analyze the correlation between the lack of FMRP and the expression of Cacna1a in primary neuronal cultures, in order to define the role of this gene and its protein in the pathophysiology of FXS. For this purpose, I carried out a functional analysis of calcium regulation using a calcium-imaging approach in mouse cultured Fmr1-Knock-Out (KO) cortical/hippocampal neurons, and I observed that these neurons display a weaker and slower Ca2+ response to KCl-dependent depolarization than wild-type (WT) neurons. Consistent with these findings, I also showed that the protein product of Cacna1a has a reduced activity/expression at the plasma membrane of mutant mice compared to WT. Altogether, my results pinpoint a new phenotype for cultured Fmr1-KO neurons and describe calcium homeostasis impairment as a new biomarker in this cellular model. In the second axis of my work, my interest further expanded toward the study of the role of Ca2+ homeostasis in different cellular populations that compose the brain in the presence and in the absence of FMRP. To better describe the cell type diversity observed during the previous neuronal imaging and define which molecular characteristics belong to which neuronal sub-group, I developed a new powerful tool called “agonist-induced Functional Analysis and Cell Sorting” (aiFACS). This technique allows to stimulate and analyze a neuronal response to a pharmacological agonist at a single-cell level and to simultaneously sort cells accordingly. Subsequent “-omic” investigation can then define the cell identity and the molecular determinants that characterize the response of WT versus Fmr1-KO neurons. By doing so, I was able to highlight a marked deregulation of interneuron excitability, which adds a step in the direction of drawing a detailed chemical map of the rodent brain.