Rôle des cytonèmes dans la sécrétion de Hedgehog chez Drosophila melanogaster

The role of cytonemes in the Hh secretion in Drosophila melanogaster

• Auteur / Autrice : Caterina Novelli
• Direction : Pascal Therond
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 22/03/2019
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : étblissement de préparation : Université de Nice (1965-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie Valrose (Nice) - Institut de Biologie Valrose
• Jury : Président / Présidente : Florence Besse
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Besse, Marcus Bischoff, Maria Dolores Martin Bermudo, Raphaël Gaudin
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Marcus Bischoff, Maria Dolores Martin Bermudo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Drosophila melanogaster

Morphogenèse

Protéine Sonic hedgehog

Mots clés libres

Hedgehog

Ihog

Cytonèmes

Morphogène

Drosophila

Hedgehog

Ihog

Cytonemes

Morphogene

Drosophila

Résumé

Notre laboratoire étudie une molécule de morphogène appelée Hedgehog (Hh) utilisant Drosophila melanogaster comme modèle animal. La voie de signalisation Hh est conservée au cours de l'évolution, des invertébrés aux vertébrés, et joue un rôle régulateur dans divers aspects du développement animal et de l'homéostasie tissulaire, tels que le renouvellement cellulaire, la réparation tissulaire et la régénération d'organes. Hh est une molécule bi-lipidique modifiée par le cholestérol au niveau de son extrémité C-terminale et par l'acide palmitique au niveau de son extrémité N-terminale, et se lie donc étroitement à la membrane plasmique. Bien que la molécule soit hydrophobe, elle exerce sa fonction sur une longue distance. Un moyen particulier utilisé par les cellules pour communiquer repose sur un mécanisme basé sur des contacts directs entre cellules via de longues extensions de filopodes à base d'actine, appelées cytonèmes. Cette nouvelle modalité de transfert d’informations est au coeur de mon projet actuel. Dans ce travail, nous avons étudié le rôle des cytonèmes dans un tissu épithélial polarisé, appelé disque imaginal de l'aile, tissu précurseur de la larve à partir duquel les ailes adultes se développent. Les cytonèmes ont été largement étudiés dans ce tissu avec l'utilisation de la surexpression d'une protéine marquée par fluorescence appelée Interference of Hedgehog (Ihog). L'expression d'Ihog est une protéine qui peut être utilisée pour stabiliser ces longues extensions membranaires, sans quoi elles sont trop fragiles et détruites par les agents de fixation classiques. Nous présentons ici Ihog, Hh et Dispatched (Disp) comme des acteurs importants de la croissance des cytonèmes. En l'absence de différents domaines Ihog, nous avons constaté une réduction significative de la longueur et du nombre de cytonèmes. En outre, la perte totale de fonction Ihog et de son homologue Boi, réduit le nombre et la longueur des cytonèmes, sans pour autant affecter l’activité à longue distance de Hh. En absence de Hh, la longueur des cytonèmes est réduite, sans modification du nombre de cytonèmes. Avec ce travail, nous proposons une nouvelle fonction non canonique de Hh sur la croissance du cytonème. Pour comprendre le rôle des cytonèmes dans la sécrétion de Hh, nous avons également analysé des disques entièrement mutants pour disp. Chez les mutants disp, l’activité longue distance de Hh est fortement restreinte aux cellules qui juxtapose la source de Hh. En augmentant le nombre et la longueur des cytonèmes contenant Hh dans le mutant disp, nous montrons que la présence de Hh sur ces structures n’est pas suffisante pour activer la voie à longue distance. En conclusion, bien que les protéines susmentionnées contribuent à la structure des cytonèmes, nous n'avons pu mesurer de corrélation directe entre la longueur des cytonèmes et l’activité à longue distance de Hh. Enfin, nous avons voulu corréler l’apparition des cytonèmes avec l’établissement du gradient de Hh in vivo. Pour ce faire, nous avons développé un deuxième modèle alternatif permettant d’étudier la formation de cytonèmes: le modèle des histoblastes abdominaux, que nous pouvons utiliser pour analyser la formation et la dynamique des extensions de membrane chez les animaux vivants. En particulier, nous avons examiné deux nids d'histoblastes dorsaux, où le groupe de cellules postérieures produit Hh et le groupe de cellules antérieures répond au signal Hh. Nos résultats indiquent que l'établissement du gradient de Hh a lieu avant la juxtaposition des deux nids et en l'absence de cytonèmes. Nous avons donc proposé que les cytonèmes qui dépendent de Ihog ne sont pas impliqués dans les premières étapes de l’établissement du gradient de Hh. En conclusion, nos travaux montrent que Hh, bien qu’il soit nécessaire à la croissance du cytonème, n’utilise pas cette structure pour un transport à longue distance, mais certainement pour permettre une communication à courte distance.

Our laboratory studies a morphogen molecule called Hedgehog (Hh) using Drosophila melanogaster as an animal model. The Hh signaling pathway is evolutionarily conserved from invertebrates to vertebrates, and plays regulatory roles in various aspects of animal development and tissue homeostasis, such as stem cell renewal, tissue repair, and organ regeneration. Hh is a dually lipidated molecule modified by cholesterol at its C-terminus and palmitic acid at its N-terminus, and therefore tightly binds the plasma membrane. Although the hydrophobic nature of the molecule, Hh exerts its function over a long-range of distance. One particular way cells adopted to communicate over long distances is through a new mechanism based on direct cell-cell contacts via long actin-based filopodia extensions, called cytonemes. This new modality for information transfer is at the core of my present project. In this work, we studied this Hh transport mechanism in a polarized epithelial tissue, called the wing imaginal disc, a larval precursor tissue from which the adult wings develop. Cytonemes have been extensively studied in this tissue with the use of the overexpression of a fluorescently tagged protein called Interference of hedgehog (Ihog). The expression of Ihog protein in the wing disc is necessary and sufficient to stabilize these long plasma membrane extensions, otherwise they would be too fragile and easy to be disrupted by conventional fixatives. Here we present Ihog, Hh and Disp as important players in cytoneme growth. In absence of different Ihog domains, we found a significant reduction of cytoneme length and numbers. In addition, Ihog/Boi loss of function was able to reduce the number and length of wild type cytonemes, marked with mCD8GFP. Further, we saw that in loss of function and gain of function genotype for Hh, cytoneme length was reduced and increased respectively, without any change at the cytoneme numbers. With this work, we suggest that Hh has a novel, non-canonical function in the cytoneme growth. To understand the role of cytonemes in Hh secretion we also analyzed discs entirely mutant for Dispatched (Disp). In disp mutants, the Hh gradient is strongly restrained, with most of Hh targets expressed only in anterior cells juxtaposing the A/P border. This phenotype could not be rescued by Ihog overexpression, despite the fact that Hh was very abundant on cytonemes in the disp mutant. Additionally, in the absence of Disp, we observed a reduction of cytoneme length, which suggests a role for Disp in the formation of these filaments, which is likely independent from its function in Hh secretion. In conclusion, although the aforementioned proteins contribute to the structure of cytonemes, we could not measure any direct correlation between the expression of Hh target genes and the simultaneous manipulation of cytoneme length in any mutant condition checked. Finally, we wanted to correlate the time of cytoneme initiation with the establishment of the Hh gradient. In order to do that, we have introduced in the laboratory an alternative system to study cytoneme formation: the abdominal histoblast model, which allowed us to directly analyze the formation and dynamics of membrane extensions in live animals. In particular, we looked at two separated dorsal histoblast nests of the pupal stage (distanced by 30 microns at the onset of pupariation) where the posterior group of cells produces Hh and the anterior cells show expression of various Hh targets. Approximately 15 hours after the onset of the metamorphosis, the abdominal histoblast cells begin to divide and migrate while simultaneously inducing apoptosis in the surrounding larval cells. Our results indicate that the establishment of the Hh gradient occurs before the juxtaposition of the two nests. Nevertheless, we could only observe cytoneme formation after the juxtaposition of the anterior and posterior histoblast cells and not when the two nests were still separated.