Impact de la flore microbienne dans la survie des cellules souches intestinales après irradiation

Impact of microbiota on intestinal stem cells survival after irradiation

• Auteur / Autrice : Antonin Levy
• Direction : Philippe Sansonetti, Eric Deutsch
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Microbiologie
• Date : Soutenance le 31/10/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Dussurget
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Sansonetti, Eric Deutsch, Olivier Dussurget, Harry Sokol, Silvia Fre, Cédric Blanpain, Lucie Peduto, Nathalie Vergnolle
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Harry Sokol, Silvia Fre

Mots clés

Mots clés contrôlés

Stress oxydatif

Auto-renouvellement cellulaire

Muqueuse intestinale

Traitement par irradiation

Récepteurs cellulaires

Stress oxydatif

Épithélium intestinal

Cellules souches

Microflore

Mots clés libres

Protéine adaptatrice de signalisation NOD2

Muramyl-dipeptide

NOD2 signaling adaptor protein

Muramyl-dipeptide

Résumé

L'épithélium intestinal est un tissu à renouvellement rapide impliquant l’activité de cellules souches intestinales (CSIs) identifiées par le marqueur LGR5. L'épithélium intestinal doit faire face à des agressions continues en relation avec ses fonctions digestives et de barrière. Le microbiote intestinal, y compris les agents pathogènes et les bactéries commensales, influence l'intégrité et la physiologie de l'épithélium intestinal. L'interaction des molécules dérivées du microbiote avec les récepteurs immunitaires innés de l'hôte est nécessaire à l'homéostasie intestinale et son rôle est encore plus important dans des conditions de stress, en particulier celles induisant un fort stress oxydatif. Les CSIs LGR5+ expriment le récepteur immunitaire inné cytosolique NOD2. Le ligand de NOD2, le muramyl-dipeptide (MDP), un motif du peptidoglycane commun à toutes les bactéries, favorise la survie des CSIs suite à un stress oxydatif, autrement mortel. Cependant, les mécanismes de protection sous-jacents demeurent encore inconnus. L'exposition de souris axéniques ou conventionnelles aux rayonnements ionisants conduit à différents résultats. Cependant, les mécanismes conférant la radiorésistance des souris axéniques sont mal compris. Des données préliminaires de notre groupe ont indiqué que les CSIs axéniques sont résistantes aux dommages induits par la chimiothérapie, suggérant que le microbiote pourrait être impliqué dans l'initiation de la sensibilité des CSIs aux agents générant un stress oxydatif. Afin de caractériser l'interaction microbiote-CSIs après irradiation ionisante, nous avons utilisé des modèles murins in vivo et in vitro (culture d’organoïde intestinaux). Nous avons constaté qu’après irradiation in vitro (i) la transcription de Nod2 était augmentée dans les CSIs et (ii) que le MDP favorisait spécifiquement la protection des CSIs. Nous avons ensuite montré que l'addition du MDP induisait une forte diminution des espèces réactives de l’oxygène (ROS) totales et mitochondriales au sein des CSIs après irradiation. Les CSIs LGR5+ présentent une activité mitochondriale élevée et les mitochondries sont une source majeure de ROS. Nous avons démontré que la mitophagie intrinsèque aux CSIs, un mécanisme important pour l’homéostasie, est activée par le MDP, ce qui suggère un rôle pour son récepteur NOD2. De plus, les organoïdes dépourvus d’une protéine impliquée dans l’autophagie (ATG16L1 KO) ne bénéficiaient pas de la protection du MDP après irradiation in vitro. La cytoprotection médiée par le MDP a cependant pu être restaurée dans le contexte ATG16L1 KO en ajoutant un agent antioxydant. Nous avons également confirmé des défauts dans le processus de mitophagie chez les organoides de souris NOD2 KO. Ces résultats permettent une meilleure compréhension des mécanismes de cytoprotection induits par le MDP et soulignent les liens entre NOD2 et autophagie.Nous avons également démontré la radiorésistance relative des cryptes des souris axéniques, comparativement aux souris témoins in vivo. De plus, les organoides de souris axéniques conservaient leur résistance relative aux rayonnements ionisants par rapport aux organoides de souris conventionnelles. Le niveau basal de ROS était plus faible dans les CSIs des animaux axéniques par rapport aux souris conventionnelles. Nous avons particulièrement montré que l'expression de la sous-unité NADPH oxydase 1 (Nox1) est régulée par le microbiote au sein des CSIs. Par conséquent, l'activation de récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) est impliquée dans l’activation de Nox1 par le microbiote.Nos données suggèrent que le microbiote joue un double rôle sur les CSIs: il régule la machinerie ROS, permettant par exemple aux CSIs de répondre aux agents pathogènes et exerce un effet cytoprotecteur après une agression.

The intestinal epithelium is a fast self-renewing tissue implicating an active intestinal stem cells (ISCs) pool uniquely identified by the LGR5 marker. The gut epithelium needs to cope with continuous stressors in relation with its digestive and barrier functions. The gut microbiota, including pathogens and commensal bacteria, influences the integrity and physiology of the gut epithelium. The interaction of microbiota-derived molecules with host innate immune receptors is required for gut homeostasis and its role is even more important upon stress conditions, particularly those inducing strong oxidative stress. LGR5+ ISCs express the cytosolic innate immune sensor NOD2. The NOD2 ligand muramyl-dipeptide (MDP), a peptidoglycan motif common to all bacteria, promotes ISCs survival over an otherwise lethal oxidative stress-mediated signal. Yet, the underlying protective mechanisms remained unknown. Exposure of axenic or conventional mice to ionizing radiation leads to different outcomes. Axenic animals display less radiation enteritis than their conventional counterparts. However, the mechanisms conferring radioresistance to axenic mice are poorly understood. Preliminary data from our group indicated that axenic-ISCs are resistant to chemotherapy-induced damages, suggesting that the microbiota might be involved in initiating the sensitivity of ISCs to oxidative-stress generating agents.To characterize the microbiota-ISCs interaction after ionizing radiation, we used both in vivo and in vitro (mini-gut organoid culture) mice models. We found that, following irradiation in vitro, (i) Nod2 transcription was increased in ISCs and (ii) MDP specifically promoted ISCs protection. We then showed that the addition of MDP induced a strong reduction of total and mitochondrial reactive oxygen species (ROS) within ISCs after irradiation. LGR5+ ISCs display high mitochondrial activity and mitochondria are the richest source of ROS. We demonstrated that ISCs-intrinsic mitophagy, an important mechanism for ISCs homeostasis, is activated by MDP, suggesting a role for its receptor NOD2. Moreover, organoids lacking autophagy protein 16 (ATG16L1 KO) did not benefit from MDP cytoprotection following irradiation in vitro. MDP-mediated cytoprotection, however, could be restored in the ATG16L1 KO context by adding a ROS-scavenging agent. We also confirmed defects in the mitophagy process in organoids from NOD2 KO mice. These findings elucidate the mechanisms of cytoprotection induced by MDP and highlight the NOD2-autophagy links. We also showed the relative radioresistance of crypts in axenic animals, compared to control mice in vivo. Additionally, organoids from axenic mice were relatively resistant to ionizing radiation in comparison with organoids from conventional mice. On the other hand, organoids from conventionalized mice (axenic mice displaced in conventional animal facilities) and antibiotic-treated mice were not relatively radioresistant. Basal level of ROS in the gut epithelium was reduced in axenic animals. We confirmed transcriptional differences in the activation of the ROS-producing machinery in ISCs from axenic mice (at basal level and after irradiation), as compared to control mice. We particularly showed that expression of the NADPH oxidase 1 subunit (Nox1) is regulated by the microbiota within ISCs. Hence, specific pattern recognition receptors activation is implicated in Nox1 priming by the microbiota.Our data suggest that the microbiota plays a dual role on ISCs: it regulates the ROS machinery, for instance allowing ISCs to respond to pathogens and it exerts a cytoprotective effect after aggression. These findings open the way to dissect additional molecular pathways involved in ISCs homeostasis and to new prospects for translation into clinical practice.