Développement et validation d’un modèle cellulaire de kératopathie associée à l’aniridie

In vitro modeling of aniridia-related keratopathy and its validation

• Auteur / Autrice : Lauriane Roux
• Direction : Daniel Aberdam, Olivier Ferrigno
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Médecine. Biothérapies
• Date : Soutenance le 28/09/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Immunologie humaine, physiopathologie & immunothérapie (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Dominique Brémond-Gignac
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Daniel Aberdam, Olivier Ferrigno, Dominique Brémond-Gignac, Stéphane Chavanas, Valérie Vanneaux, Ruby Shalom Feuerstein
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Cécile Martinat, Stéphane Chavanas

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine-9 associée à CRISPR

Maladies de la cornée

Facteur de transcription PAX6

CRISPR-Cas9

Aniridie

Mots clés libres

Cellules épithéliales limbiques

Protéine recombinante

Limbal epithelial cells

Recombinant protein

Résumé

L’aniridie est une pathologie rare principalement due à des mutations hétérozygotes sur PAX6, le gène contrôlant le développement oculaire et le maintien de l’homéostasie cornéenne. Elle est caractérisée par une hypo/aplasie de l’iris, des atteintes de la rétine et du cristallin. La totalité des patients atteints développe aussi une kératopathie associée à l’aniridie (KAA), conduisant à une opacification progressive de leur cornée. La KAA a pour origine un déficit en cellules souches limbiques et diverses perturbations de l’épithélium et du stroma cornéens. Actuellement, il n’existe ni traitement pour soulager efficacement les patients, ni modèle cellulaire pour cette pathologie. Afin de pallier ces manques, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour intégrer une mutation hétérozygote non-sens dans le gène PAX6 de cellules épithéliales limbiques immortalisées. Les cellules mutées présentent une expression réduite de PAX6 et une modulation de celle de ses gènes cibles, un ralentissement de la prolifération, de la clonogénicité et de la migration ainsi qu’une adhésion accrue. De plus, nous avons montré qu’un traitement de ces cellules avec une protéine recombinante PAX6, portant un peptide de pénétration cellulaire, permet une induction de l’expression endogène de PAX6 et également une restauration partielle du phénotype décrit précédemment. Cette réversion phénotypique valide le modèle d’haploinsuffisance développé et suggère l’implication de PAX6 dans les différentes fonctions restaurées. Les cellules mutées peuvent maintenant être utilisées pour le criblage d’outils thérapeutiques potentiels pour la KAA et pour d’autres défauts liés à une diminution du dosage de PAX6.

Aniridia is a rare panocular disease mainly due to PAX6 heterozygous mutations. PAX6 is the master gene of the eye development and it controls also the corneal homeostasis maintenance. Aniridia is characterized by an iris hypo/aplasia, retina and lens defects. All the aniridia patients will also develop an aniridia-related keratopathy (ARK) leading to a progressive corneal opacification. ARK is due to a limbal stem cell deficiency and alterations of corneal epithelium and stroma functions. Unfortunately, there is currently no efficient treatment to relief the patients and no cellular model for this pathology. To remedy these lacks, CRISPR/Cas9 system was used to insert a nonsense mutation into PAX6 gene of immortalized limbal epithelial cells. The mutated cells produce less PAX6 than the wild-type and PAX6 targets gene expression was modulated. They also display a marked slow-down proliferation, clonogenicity, migration and an enhanced adhesion. Moreover, we have shown that addition of recombinant PAX6 protein fused to a cell penetrating peptide to the culture medium was able to activate the endogenous PAX6 expression and to rescue some phenotypic defects of the mutated cells. Therefore, it validates the PAX6 haploinsufficiency model and suggests that PAX6 could be involved in all the rescued functions. The mutated cells can now be used to screen potential therapeutic tools for ARK and for other defects due to low levels of PAX6.