Etude de l’épissage alternatif dans le sarcome d’Ewing

Deciphering the splicing landscape of Ewing sarcoma

• Auteur / Autrice : Olivier Saulnier
• Direction : Olivier Delattre, Martin Dutertre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Medecine. Oncogénèse
• Date : Soutenance le 26/11/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité
• Jury : Président / Présidente : Jean Soulier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Delattre, Martin Dutertre, Jean Soulier, Reini Luco, Heinrich Kovar, Françoise Redini, Eric Letouzé, Franck Dequiedt
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Reini Luco, Heinrich Kovar

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épissage alternatif

Cancérogenèse

Sarcome d'Ewing

Mots clés libres

EWS-FLI1

RBFOX2

ERG

Résumé

Certains cancers peuvent être caractérisés par un facteur de transcription aberrant. C’est le cas du sarcome d’Ewing qui est caractérisé par une translocation chromosomique générant une protéine de fusion appelée EWSR1-ETS. Ces protéines de fusion ont principalement été étudiées en tant que facteur de transcription car elles ont la capacité de se fixer sur des séquences de type répétition de GGAA dans le génome et d’activer la transcription de nombreux gènes. Les fusions EWSR1-ETS ont aussi la capacité de recruter les protéines du complexe du remodelage de la chromatine afin d’augmenter l’accessibilité aux régions riches en répétition de GGAA et donc promouvoir un programme transcriptionnel aberrant. Cette propriété dépend majoritairement de la partie EWSR1 et de son domaine de faible complexité qui lui permet, notamment, d’interagir avec de nombreuses protéines. Les fusions EWSR1-ETS ont aussi été impliquées dans la régulation de l’épissage alternatif ; mais à ce jour cette fonction reste peu décrite et est principalement attribuée à la partie EWSR1. Cependant, il a récemment été montré que la protéine ERG (qui est très homologue à FLI1) contrôle la stabilité des ARN messagers. Ces observations nous ont mené à tester le rôle potentiel de ERG (et par conséquent de FLI1) dans l’épissage alternatif afin de mieux décrire les mécanismes impliqués dans la régulation de l’épissage alternatif induite par les protéines de fusion EWSR1-ETS dans le sarcome d’Ewing. Ce travail a permis d’identifier une nouvelle fonction des protéines de la sous-famille ERG (ERG, FLI1 et FEV) dans la régulation de l’épissage alternatif. Nous avons montré que les protéines ERG interagissent avec RBFOX2, un régulateur de l’épissage et que ERG et RBFOX2 induisent une régulation de l’épissage similaire suggérant, ainsi, un mécanisme de collaboration. Nos résultats démontrent que ERG interagit avec RBFOX2 par son extrémité C-terminale. De manière intéressante, ce domaine est retenu dans les fusions EWSR1-ETS. Nous avons donc confirmé que les fusions EWSR1-ETS étaient aussi capable d’interagir avec RBFOX2 et d’induire un programme d’épissage alternatif commun. Cependant, au contraire de la collaboration observée pour ERG et RBFOX2, nous avons montré que les fusions EWSR1-FLI1 ont un rôle opposé sur le programme d’épissage de RBFOX2. Nous avons également montré que EWS-FLI1 induisait l’épissage alternative du gène ADD3 ce qui a pour conséquence la répression du phénotype mésenchymateux des cellules du sarcome d’Ewing. Notre travail a permis d’identifier de nouveaux mécanismes afin de mieux comprendre comment la dérégulation de l’épissage alternatif par des facteurs de transcriptions oncogéniques influent sur la biologie du sarcome d’Ewing.

Cancer can be characterized by abnormal fusion transcription factors. These transcription factors may have gain of function, neomorphic DNA binding properties or aberrant transcriptional activity. This is the case for Ewing sarcoma, which is characterized by a chromosomal translocation EWSR1-ETS. Ewing sarcoma fusion oncoproteins have been mostly studied as aberrant transcription factors due to their ability to specifically bind GGAA repeat sequences and to activate de novo enhancers. In addition, its ability to recruit chromatin-remodeling proteins, to induce chromatin opening and to drive an aberrant transcriptional program is a neomorphic property of the EWSR1 moiety that depends on its low complexity domain. EWSR1-ETS fusions have recently been implicated in alternative splicing regulation but to date this function is mainly attributed to the EWSR1 part. However, ERG protein, a member of the ETS transcription factor family, has been lately shown to control post-transcriptional processes such as mRNA stability. Considering these observations, we decided to challenge this view by studying ERG as a bona fide splicing regulator. This work highlights a new function of ERG subfamily proteins (ERG, FLI1 and FEV) in alternative splicing regulation. We have shown that ERG proteins interact with the master splicing regulator RBFOX2 to similarly regulate a common splicing program. We demonstrated that this new function is mediated via protein-protein interaction through the C-terminal domain of ERG. Because this domain remains in EWSR1-ETS fusions, we demonstrated that EWSR1-FLI1 protein is still able to bind RBFOX2 as expected. In addition, EWSR1-FLI1 induces massive changes of the splicing landscape of Ewing sarcoma and regulates an RBFOX2-dependent splicing program. However, in contrast to the collaborative effect observed for ERG, we found that EWSR1-FLI1 antagonizes RBFOX2-splicing function by repressing RBFOX2 binding to its pre-mRNAs targets. Importantly, we have found that mis-splicing of ADD3 by EWS-FLI1 leads to the repression of the mesenchymal phenotype of Ewing sarcoma cells. Our study provides direct evidence to understand how splicing dysregulation by an oncogenic transcription factor impacts on Ewing sarcoma biology.