Etude fonctionnelle des glycoprotéines d'enveloppe du réservoir VIH-1

Genetically intact but functionally impaired HIV-1 Env glycoproteins in the T-cell reservoir

• Auteur / Autrice : Anne Huard de Verneuil
• Direction : François Clavel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Microbiologie
• Date : Soutenance le 30/03/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique des Virus et Pathogénèse des Maladies Virales (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Emmanuel Ceccaldi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Clavel, Pierre-Emmanuel Ceccaldi, Francis Barin, Lucie Etienne, Jean-Daniel Lelièvre, Clarisse Berlioz-Torrent
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Francis Barin, Lucie Etienne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Gènes env

ARN messagers

Quiescence cellulaire

Glycoprotéines

VIH (virus)

Mots clés libres

LT CD4+ quiescent

Syndrome d'hyper-IgM lié à l'X

Resting CD4+ T cells

Hyper-IgM immunodeficiency syndrome, type 1

Résumé

Le réservoir VIH-1 des lymphocytes T CD4+ quiescents présente seulement une faible proportion de génomes intacts. La fonctionnalité des protéines virales codées par ces séquences n’a pas encore été complétement élucidée. Lors de cette étude, je me suis concentrée sur l’expression et la fonctionnalité de la glycoprotéine d’enveloppe du VIH, qui est une cible majeure du système immunitaire et un important agent pathogène. Les lymphocytes T CD4+ quiescents ont été isolés à partir de prélèvements sanguins de patients sous traitement antirétroviral dont la charge virale était contrôlée depuis plus de 4 ans. Les séquences du gène env ont été obtenues à partir de deux sources : soit les cellules ont été stimulées et cultivées en condition de dilution limite avec des cellules cibles pour permettre la propagation de virus clonaux en culture (VOA), soit les ARN viraux produits par les cellules après stimulation ont été extraits et amplifiés par RT-PCR. Les gènes env ont été clonés dans un plasmide d’expression et séquencés. L’expression des protéines a été quantifiée par Western Blot, cytométrie, et immunofluorescence. La fonctionnalité des glycoprotéines d’enveloppe a été mesurée par un test de fusion cellule-cellule et un test d’infectivité de pseudo-particules virales. Toutes les séquences env issues des VOA sont intacts alors que 26% de celles dérivées des ARNm des LT CD4+ quiescents présentent des mutations. Plus le patient est traité précocement, plus la diversité virale de son réservoir est restreinte. Pour les tests de fusion et d’infectivité, seules les séquences intactes ont été testées. Les enveloppes du réservoir VIH-1 ne sont pas toutes fonctionnelles : une grande proportion des Envs dérivées des ARNm (27.5%) sont peu fonctionnelles par rapport au contrôle positif (< 25%) et 14% ne présentent aucune activité fusogénique détectable. Les enveloppes des virus de VOA sont plus fusogéniques que celles dérivées des ARNm : 90% des enveloppes des virus de VOA sont au dessus de 50% de la fonctionnalité du contrôle positif contre seulement 41% pour les enveloppes dérivées des ARNm. L’étude des glycoprotéines d’enveloppe par Western Blot et par cytométrie a permis d’établir respectivement une corrélation entre leur niveau d’expression et leur fonctionnalité ainsi qu’entre le nombre de cellules les exprimant à leur surface et leur fonctionnalité. Les défauts de fusogénicité et d’infectivité des Env du réservoir sont essentiellement dus à un problème d’expression, de maturation, de stabilité et/ou d’adressage à la surface cellulaire. Ces défauts pourraient contribuer à l’accumulation de séquences apparemment intactes mais défectueuses au sein du réservoir VIH-1. En outre, ces glycoprotéines d’enveloppe pourraient échapper à l‘immunité lors des stratégies de « kick and Kill ».

Genetically intact but functionally impaired HIV-1 Env glycoproteins in the T-cell reservoir.HIV-infected subjects under ART harbor a persistent viral reservoir in resting CD4+ T-cells, which accounts for the resurgence of HIV-1 replication after ART interruption. A large majority of HIV reservoir genomes are genetically defective, but even among intact proviruses, few seem able to generate infectious virus. To understand this phenomenon, we have examined the function and expression of HIV envelope glycoproteins reactivated from the reservoir of HIV-infected subjects under suppressive ART. We studied full-length genetically intact env sequences from both replicative viruses and cell-associated mRNAs. We found that these Env proteins varied extensively in fusogenicity and infectivity, with strongest functional defects found in Envs from cell-associated mRNAs. Env functional impairements were essentially explained by defects in Env protein expression. Our results support the idea that defects in HIV Env expression, preventing cytopathic or immune HIV clearance, contribute to the persistence of the HIV T-cell reservoir in vivo. In most individuals, evolution of HIV infection is efficiently controlled on the long-term by combination antiviral therapies. These treatments, however, fail to eradicate HIV from the infected subjects, a failure that results both in resurgence of virus replication and in resumption of HIV pathogenicity when the treatment is stopped. HIV resurgence, in these instances, is widely assumed to emerge from a reservoir of silent virus integrated in the genome of a small number of T lymphocytes. The silent HIV reservoir is mostly composed of heavily deleted or mutated HIV DNA. Moreover, among the seemingly intact remaining HIV, only very few are actually able to efficiently propagate in tissue culture. In this study, we find that intact HIV in the reservoir often carry strong defects in their capacity to promote fusion to neighboring cells and infection of target cells, a defect related to the function and expression of the HIV envelope glycoprotein. Impaired envelope glycoprotein expression and function could explain why cells harboring these viruses tend to remain undetected and unharmed in the reservoir.