Régulation de l'expression du gène Nodal lors de la différenciation des cellules souches embryonnaires

Regulation of Nodal gene expression during mouse embryonic stem cells differentiation

• Auteur / Autrice : Mathieu Vieira
• Direction : Jérôme Collignon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Génétique
• Date : Soutenance le 26/09/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Jacques Monod (Paris ; 1997-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Alain Zider
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alain Zider, Déborah Bourc'his, Véronique Azuara, Slimane Ait-Si-Ali, Alice Jouneau
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Déborah Bourc'his, Véronique Azuara

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine Smad-4

Cellules souches embryonnaires de souris

Régulation de l'expression des gènes

Protéine Nodal

Épigénétique

Régulation génétique

Mots clés libres

EpiSC

Amplificateur HBE

Amplificateur ASE

EpiSC

Enhancer HBE

Enhancer ASE

Résumé

L'influence des signalisations ACTIVINE/NODAL et FGF sur les cellules souches embryonnaires murines (mESC) déclenchent leurs différenciations en cellules analogues aux EpiSC (EpiLCs). Cette différenciation modifie les niveaux d'expression des facteurs de pluripotence et il va promouvoir un changement global de l'expression génique. C'est notamment le cas pour le gène Nodal. Alors que son expression est dépendante des facteurs de transcription liés à son enhancer HBE dans les mESCs, il devient principalement dépendant de sa boucle de rétro-contrôle positive médiée par l'enhancer ASE (dépendant de la signalisation ACTIVINE/NODAL) dans les EpiLCs. De précédentes études effectuées au laboratoire ont mis en évidence que les mESCs où HBE a été enlevé sont incapables d'exprimer Nodal une fois différenciées en EpiLCs, démontrant que, bien qu'HBE ne soit pas nécessaire à l'expression de Nodal en EpiLC, sa présence est requise en mESC pour assurer l'expression ultérieure de Nodal en EpiLC (Papanayotou et al 2014). Cette découverte soulève la question de savoir si HBE exerce son contrôle directement sur ASE ou bien via d'autres régions régulatrices du locus. On peut également se demander par quels intermédiaires moléculaires (changements chromatiniens) se contrôle à lieu et quels sont les facteurs impliqués (modificateurs ou remodeleurs de la chromatine, facteurs de pluripotence). Pour répondre à ces questions j'ai tout d'abord généré des délétions spécifiques de HBE et ASE dans les mESCs en utilisant l'outil d'édition génétique CRISPR/Cas9. J'ai ensuite caractérisé l'impact de ces délétion sur l'expression de Nodal par RT-qPCR et imagerie en temps réel d'un rapporteur NodalcondHBE-YFP endogène. Alors que HBE est essentiel à l'expression de Nodal en mESC j'ai également découvert que ASE contribue à l'expression de Nodal dans ces cellules. Pour disséquer le fonctionnement de HBE j'ai généré des lignées de mESCs manquant des régions de HBE qui sont conservé chez les mammifères. L'impact de ces délétions m'ont permis d'identifier le domaine HBE2 comme étant responsable de l'activité transcriptionnelle de HBE dans les mESCs. Ce domaine contribue également à l'activité de Nodal dans les EpiLCs, démontrant que bien que HBE ne soit pas essentiel à l'expression de Nodal en EpiLC, il participe tout de même à son expression. Aucun domaine de HBE ne semble être seul responsable du contrôle de l'activation de l'ASE dans les EpiLCs. Cette fonction semble ainsi être distincte de l'activité transcriptionnelle de HBE. Une analyse par ChIP-qPCR dans les mutants HBE-/- et ASE-/- ont révélé que les modifications d'histones présentes sur le promoteurs et sur ces enhancers étaient différentes. Ces données nous laissent envisager que la maintenance du paysage épigénétique du locus Nodal implique des interactions entre ces différents éléments régulateurs. L'analyse de différentes données d'immuno-précipitation de la chromatine ont mis en évidence une liste de facteurs de transcription recrutés au locus Nodal. Différents éléments suggèrent que des facteurs de transcription présents sur ASE contrôlent son activité et sont affectés par la présence de HBE. Ce travail mets en lumière un mécanisme de régulation génique inédit. Ce travail est également un premier pas vers la mise en évidence d'un nouveau mécanisme responsable de la réorganisation de la régulation transcriptionnelle du génome au cours de la différenciation des mESCs en EpiLCs.

Exposure of embryonic stem cells (mESCs) to ACTIVIN/NODAL and FGF signaling initiates their differentiation into EpiSC-like cells (EpiLCs). This exposure triggers changes in the expression levels of pluripotency factors, and promotes a global shift in gene expression. Remarkably, most of the genes that maintain their expression during this differentiation also undergo a shift in their regulation from one enhancer to another. This is notably the case of the Nodal gene itself. While its expression is dependent on pluripotency factors interacting with its enhancer HBE in mESCs, it is primarily dependent on its auto-regulatory (ACTIVIN/NODAL signaling-dependent) ASE enhancer in EpiLCs. Work in the lab has however shown that mESCs where HBE has been removed are unable to express Nodal once they are differentiated into EpiLCs, revealing that, although EpiLCs do not require HBE to express Nodal, its presence is required in mESCs to ensure later Nodal expression in EpiLCs (Papanayotou et al., 2014). One question raised by this finding is whether HBE exerts its control over Nodal expression solely via its interaction with the promoter or whether it involves HBE directly influencing ASE or other Nodal regulatory regions. Another concerns the nature of the molecular means (chromatin changes) deployed to exert this control and the identity of the factors involved (chromatin remodelers and modifiers, pluripotency factors). To answer these questions I first started to generate specific deletions of HBE and ASE in mESCs using CRISPR/Cas9-mediated genome-editing. I then characterized the impact of these deletions on Nodal expression using qPCR and live imaging of a knocked-in NodalcondHBE-YFP reporter. Although HBE is essential for Nodal expression in mESCs, I found that ASE also contributes to Nodal expression in these cells. To dissect HBE functions I generated mESC lines deleted for sequence conserved subdomains of HBE. Analysis of the impact of these deletions allowed me to find that only one of these subdomains, HBE2, is essential for HBE transcriptional activity in mESC. This subdomain also contributes to Nodal expression in EpiLCs, highlighting the fact that although HBE is not essential to Nodal expression in EpiLCs it does contribute to maintaining its level. However, in contrast to the deletion of the entire HBE, none of these subdomains deletions affected the ability of ASE to drive Nodal expression in EpiLCs, indicating that the distinct functions of HBE in the regulation of Nodal expression can be experimentally dissociated and their molecular basis investigated. Furthermore, ChIP-qPCR analyses revealed that the deletion of HBE or ASE both affected histone mark profiles at the promoter and at the other regulatory element, supporting the view that the maintenance of the epigenetic landscape at the Nodal locus involves multiple interactions between its various regulatory elements. The analysis of ChIP-seq datasets and ChIP-qPCR results has allowed me to compile a list of transcription factors known to bind the Nodal locus. Interestingly, key transcription factors controlling ASE activity could be affected by the presence of HBE. This work unfolds a novel mechanism of gene regulation involving enhancer interaction. This thesis is also the first step towards revealing a new mechanism at place during the reorganization of the transcriptional landscape during mESC to EpiLC differentiation.