Approches interdisciplinaires du domaine des vésicules extracellulaires : nouvelles méthodes et outils pour le transfert en clinique en médecine régénérative et délivrance de médicaments

Physical and interdisciplinary approaches of the extracellular vesicle field : new tools and techniques toward clinical translation in regenerative medicine and drug delivery

• Auteur / Autrice : Max Piffoux
• Direction : Florence Gazeau, Amanda Andriola Silva Brun-Graeppi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique
• Date : Soutenance le 21/09/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Matière & Systèmes Complexes (Paris ; 2001-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Jacques Lataillade
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Gazeau, Amanda Andriola Silva Brun-Graeppi, Jean-Jacques Lataillade, Jérôme Guicheux, Grégory Lavieu, Marc Pocard, Claire Wilhelm, Olivier Nosjean
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jérôme Guicheux, Grégory Lavieu

Mots clés

Mots clés contrôlés

Médecine régénérative

Systèmes de délivrance de médicaments

Vésicules extracellulaires

Microscopie électronique en transmission

Cicatrisation

Fistules

Insuffisance cardiaque

Cisaillement (mécanique)

Vésicules extracellulaires

Mots clés libres

Microscopie en milieu liquide

Chargement de médicaments

Production à haut rendement

Délivrance locale

Montée en échelle

Liquid transmission electron microscopy

Drug loading

High yield production

Local delivery

Scale up

Résumé

Les vésicules extracellulaires sont des nano-vésicules (100nm) comprenant les exosomes, microvesicules et corps apoptotiques, sécrétées par toutes les cellules de l’organisme. Elles ont des rôles physiologiques et physiopathologiques dans l’hémostase, l’inflammation, la transmission d’information et de molécules biologiques, les métastases, ou la régénération tissulaire. Par exemple, des vésicules issues de cellules souches mésenchymateuses ont le même effet que leur cellule mère dans la régénération du myocarde infarci, mais ont beaucoup d’avantages par rapport à ces dernières : possibilité de les conserver au congélateur, peu immunogènes, ne provoquant pas d’embolies, pas de risque de différentiation anarchique, etc. Toutefois, l’utilisation en clinique de ces vésicules reste difficile pour des raisons pratiques : très faible production par les cellules, difficulté à les caractériser, méthodes de chargement avec des agents thérapeutique peu reproductible, méthodes d’imagerie ou de d’ingénierie peu efficientes, etc. Nous avons développé des méthodes pour répondre à ces défis, croisant la biologie, la pharmacie et la physique, et avons pu découvrir que certaines de ces techniques pouvaient être utilisées dans d’autres domaines et pour d’autres indications. En pratique, pour répondre au problème de la caractérisation des vésicules, nous avons proposé une nouvelle méthode d’imagerie utilisant le microscope électronique en cellule liquide « in situ » pour observer des vésicules dans leur milieu liquide en temps réel, et peut être utilisé pour observer d’autres matériaux et phénomènes comme les liposomes ou des processus biologiques. Nous avons proposé une nouvelle méthode de chargement des vésicules avec des molécules thérapeutiques en les fusionnant avec des liposomes, permettant la délivrance d’agents de chimiothérapie plus efficacement que des liposomes. La méthode de production des vésicules à grand rendement a nécessité 3 d’itérations successives, toutes basées sur le même concept de vésiculation induite par une contrainte mécanique, et a abouti à une méthode efficace, scalable, et conformes aux standards de production pharmaceutique. La protéomique de ces vésicules montre des expressions de protéines plus proche d’un sous type de vésicule issues de la membrane plasmique appelées microvésicules. Les vésicules issues de cette méthode ont été testées in vitro avec succès, induisent un phénotype régénératif dans des modèles cicatrisation de fistule cutanéo-digestives et des modèles murins d’insuffisance cardiaque chronique. D’autres études sur les vésicules produites par cette méthode sont en cours sur la régénération osseuse, articulaire et cérébrale, ou la délivrance de médicaments et sur l’inhibition du phénomène métastatique en cancérologie. Nous commençons aujourd’hui à défricher le transfert de ces vésicules en clinique par le biais de productions en conditions pharmaceutiques dites et de la mise en place d’une start-up.

Extracellular Vesicles, encompassing exosomes, microvesicles, apoptotic bodies are nanosized vesicles secreted by most cells of the organism, that demonstrated physiologic and physio-pathologic roles in various processes like hemostasis, metastasis, information transfer through biological macromolecules or more recently in inflammation resolution in regenerative medicine. Therapeutic use of these EVs, in particular as drug delivery systems or as a regeneration triggering agent is of a major interest, for example the use Mesenchymal Stem Cells derived EVs after myocardial infarction or stroke. EV recapitulate their parental cell effect and benefit from unique opportunities like off the shelf availability, low immunogenicity and no anarchic differentiation or pulmonary embolism. However, major obstacles are still to be faced in the field, like the EV drug loading, engineering, targeting, characterization, delivery method and GMP high yield production toward clinical translation. We developed new methods to respond to these needs at the crossroad of biology, physics, pharmacy and medicine, and discovered meanwhile that some of these techniques can be used in other fields and indications. As an example, a new liquid cell transmission electron microscopy labeling method was used to investigate live in situ at the nanoscale level EVs behavior, and can be used for other “soft” materials like liposomes or biology processes. The PEG induced liposome/EV fusion method was designed to produce biological/synthetic hybrids with engineered membrane properties and drug loading. A first response to the production problem was made designing a microfluidic chip allowing shear stress application to trigger EV production. The concept of shear stress triggered EV release was also used in the design of 2nd generation system for high yield, scalable and compliant with Good Manufacturing Practice, EV production method that uses a controlled shear stress to induce EV secretion. These EVs were tested in regenerative medicine models of fistula healing and chronic heart insufficiency confirming the interest of a new local delivery method using thermosensitive gels and their potency compared to parental cells. Our team is now exploring the scale-up, immunogenicity, and stability of these EVs and benchmarking their cost/efficiency in various models to pave the way toward the democratization of EV-based regenerative medicine through a company/platform creation.