Rôle et régulation de la kinase PLK-1 lors de l'entrée en mitose dans l'embryon de Caenorhabditis elegans

Role and regulation of PLK-1 during mitotic entry in Caenorhabditis elegans early embryo

• Auteur / Autrice : Lisa Martino
• Direction : Lionel Pintard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie. Développement
• Date : Soutenance le 01/02/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Jacques Monod (Paris ; 1997-....)
• Jury : Président / Présidente : Alain Zider
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Lionel Pintard, Alain Zider, Monica Gotta, Olivier Gavet, Marie Delattre, Izabela Sumara
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Monica Gotta, Olivier Gavet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Complexe protéique du pore nucléaire

Phosphorylation

Cycle cellulaire

Mitose

Protéines kinases

Mots clés libres

Aurora A

Bora/SPAT-1

Résumé

Lors de la division cellulaire, une cellule mère doit dupliquer (interphase) puis ségréger son matériel génétique de façon égale entre les deux cellules filles (mitose). Entre ces deux étapes, la cellule subit une réorganisation drastique gouvernée par l’acteur majeur Cdk1-Cycline B, conduisant à l’entrée en mitose. L’activation de cette kinase est régulée par une boucle d’auto-amplification où les premières molécules de Cdk1-Cycline B stimulent l’activation des suivantes. Il a été montré que la kinase Plk1 initie cette boucle d’auto-amplification en stimulant les activateurs et en réprimant les inhibiteurs de Cdk1-Cycline B en amont. Pour que cette kinase soit totalement active, elle doit être elle-même activée par Aurora A, en présence de son co-activateur Bora. Il est crucial de comprendre comment tous ces acteurs se coordonnent dans l’espace et dans le temps pour déclencher l’entrée en mitose car un dérèglement pourrait amener à une ségrégation de l’ADN anarchique, conduisant à la formation de tumeurs et l’apparition de cancers. Au cours de ma thèse, j’ai tout d’abord contribué à la mise en évidence d’un mécanisme conservé d’activation de Plk1 dans les cellules humaines et chez C. elegans (PLK-1), impliquant le co-activateur Bora ou SPAT-1 chez C. elegans. Nous avons montré que la phosphorylation de SPAT-1 par Cdk1-Cycline B induit son interaction avec PLK-1, ce qui promeut la phosphorylation de PLK-1 par Aurora A et donc son activation in vitro. Ce mécanisme phospho-dépendant de SPAT-1 est important in vivo pour contrôler dans le temps l’entrée en mitose. De plus, l’activation de Plk1 in vitro avec les protéines humaines suggèrent fortement une conservation du mécanisme. Nous avons ensuite montré que la phosphorylation de Bora et de SPAT-1 par Cdk1 sur les résidus S41, S112, S137 et S119, S190, T229 respectivement, est nécessaire à leur interaction avec Plk1/PLK-1, déclenchant ensuite l’activation de Plk1/PLK-1 et l’entrée en mitose. Ces résultats démontrent que Bora/SPAT-1 phosphorylée fait partie de la boucle d’auto-amplification de Cdk1-Cycline B via l’activation de Plk1, permettant à terme d’activer de façon irréversible les acteurs de l’entrée en mitose. Par la suite, je me suis focalisée sur le rôle de PLK-1 dans la rupture de l’enveloppe nucléaire en utilisant l’embryon de C. elegans comme système modèle. Après avoir démontré que PLK-1 est cruciale pour la rupture de l’enveloppe nucléaire dans les embryons, j’ai observé une localisation de PLK-1 à l’enveloppe nucléaire avant sa rupture et j’ai identifié un complexe de nucléoporines impliqué dans ce processus. En effet, NPP-1, NPP-4 et NPP-11 dont la fonction est de réguler le transport nucléo-cytoplasmique, ont également un second rôle dans le recrutement de PLK-1 aux pores nucléaires. PLK-1 interagit avec ses substrats phosphorylés par deux types de mécanismes d’amorçage Plk1-dépendant et indépendant, impliquant une autre kinase en amont comme Cdk1-Cycline B par exemple. J’ai montré que le recrutement de PLK-1 aux pores dépend des deux mécanismes, nécessitant donc une coordination entre Cdk1-Cycline B et PLK-1. Une fois que PLK-1 est au centre du pore nucléaire, elle peut alors probablement phosphoryler de nombreuses nucléoporines et participer au désassemblage des pores, conduisant à la rupture de l’enveloppe nucléaire.

During cell division, a mother cell duplicates (interphase) and then segregate its genetic material equally between the two daughter cells (mitosis). Between these two stages, the cell undergoes a drastic reorganization governed by the major actor Cdk1-Cyclin B, leading to mitotic entry. The activation of this kinase is regulated by an auto-amplification loop where the first molecules of Cdk1-Cyclin B stimulate activation of the following. Plk1 kinase has been shown to initiate this self-amplification loop by stimulating activators and repressing upstream Cdk1-Cyclin B inhibitors. For this kinase to be fully active, it must itself be activated by Aurora A, in the presence of its coactivator Bora. It is crucial to understand how all these actors coordinate in space and time to trigger mitotic entry because a disruption could lead to a segregation of anarchic DNA, leading to the formation of tumors and the appearance of cancers. During my thesis, I first contributed to demonstrate a conserved mechanism of Plk1 activation in human cells and in C. elegans (PLK-1), involving the coactivator Bora or SPAT-1 in C. elegans. We have shown that the phosphorylation of SPAT-1 by Cdk1-Cyclin B induces its interaction with PLK-1, which promotes the phosphorylation of PLK-1 by Aurora A and thus its activation in vitro. This phosphory-dependent mechanism of SPAT-1 is important in vivo for controlling the entry into mitosis over time. In addition, activation of Plk1 in vitro with human proteins strongly suggests conservation of the mechanism. We then showed that the phosphorylation of Bora and SPAT-1 by Cdk1 on residues S41, S112, S137 and S119, S190, T229 respectively, is necessary for their interaction with Plk1 / PLK-1, then triggering the activation of Plk1 / PLK-1 and mitotic entry. These results demonstrate that phosphorylated Bora / SPAT-1 is part of the self-amplification loop of Cdk1-Cyclin B via the activation of Plk1, ultimately enabling irreversible activation of the actors of mitotic entry. Subsequently, I focused on the role of PLK-1 in nuclear envelope breakdown using the C. elegans early embryo as a model system. After demonstrating that PLK-1 is crucial for the nuclear envelope breakdown in embryos, I observed a localization of PLK-1 to the nuclear envelope before its rupture and I identified a nucleoporin complex involved in this process. Indeed, NPP-1, NPP-4 and NPP-11 whose function is to regulate nucleo-cytoplasmic transport, also have a second role in the recruitment of PLK-1 to nuclear pores. PLK-1 interacts with its phosphorylated substrates by two types of Plk1-dependent and independent priming mechanisms, involving another upstream kinase such as Cdk1-Cyclin B for example. I have shown that the recruitment of PLK-1 to the pores depends on both mechanisms, thus requiring coordination between Cdk1-Cyclin B and PLK-1. Once PLK-1 is at the center of the nuclear pore, it can probably phosphorylate many nucleoporins and participate in the disassembly of pores, leading to tnuclear envelope breakdown.