Nouveaux modèles pour l'étude de l'hétérogénéité phénotypique de Cryptococccus neoformans

par Benjamin Hommel

Thèse de doctorat en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Françoise Dromer.

Le président du jury était Philippe Silar.

Le jury était composé de Françoise Dromer, Philippe Silar, Cécile Fairhead, Patrice Le Pape, Isabelle Sagot, Christophe Beloin.

Les rapporteurs étaient Cécile Fairhead, Patrice Le Pape.


  • Résumé

    Les champignons sont soumis aux changements de leur l’environnement que ce soit par compétition avec d’autres microorganismes ou des facteurs de stress et développent des stratégies complexes pour assurer leur survie. Notamment, l’hétérogénéité phénotypique déclenchée par l'interaction avec l'hôte est remarquable chez la levure Cryptococcus neoformans (C.n.). L’existence d’un phénotype dormant / quiescent a été caractérisée chez C.n. à partir d’un faisceau d’arguments cliniques, épidémiologiques et expérimentaux. Cette population se situerait au sein d’un granulome pulmonaire. En faisant un parallèle avec la privation en nutriments et l’hypoxie régnant au sein du granulome, il a été mis au point un protocole in vitro faisant intervenir ces deux paramètres. Ce protocole a permis une caractérisation biologique du phénotype dormant, sous la forme de cellules viables mais non cultivables (VBNC). Par différentes approches protéomiques, le rôle de voies de signalisation comme mTOR et du métabolisme des acides gras avec la participation de l’acétyl-coenzyme A ont été déterminées. Avec le précurseur de ce coenzyme, l’acide pantothénique (vitamine B5) par ailleurs facteur de « quorum sensing » secrété chez C.n., il a été possible de rendre à nouveau cultivable une proportion de cette population VBNC. Au cours de l'infection, dans le tissu pulmonaire, une augmentation de la taille des cellules a été observée. Passant de 5-7µm à plus de 10 ?m, ces cellules sont devenues des cellules titans. Cependant, la génération reproductible de ces cellules était seulement possible durant l’infection expérimentale. Nous avons donc développé un protocole in vitro de génération de cellules titans qui a permis l’étude des facteurs influençant leur génération (facteurs d’hôte, de champignon, environnementaux). Une étude génétique comparative a lié le phénotype avec le génotype. Dans un premier temps, l’utilisation de souches provenant de la lignée H99, parmi lesquelles peu de différences génétiques sont été décrites, a montré que la formation de cellules titans dépendait de Lmp1, Sgf29 et des protéines Gpr4 / 5-Rim101. Ensuite, l’étude d’isolats cliniques a démontré le rôle de Pkr1 comme régulateur négatif de la génération de cellules titans. Le développement de ces nouveaux modèles a constitué une approche originale pour étudier en laboratoire l’hétérogénéité phénotypique de C.n. avec en particulier deux phénotypes : les cellules dormantes et les cellules titans. Nos résultats fournissent de nouvelles perspectives sur la biogenèse de ces phénotypes avec l'identification de plusieurs facteurs / voies impliqués. Les conditions identifiées pour la génération de ces phénotypes fournissent des systèmes robustes qui pourraient être précieux pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent leurs générations.

  • Titre traduit

    New models to study phenotypic heterogeneity of Cryptococcus neoformans


  • Résumé

    Fungi are subject to changes in their environment whether by competition with other microorganisms or stressors and develop complex strategies to ensure their survival. In particular, the phenotypic heterogeneity triggered by the interaction with the host is remarkable in the yeast Cryptococcus neoformans (C.n.). The existence of a dormant / quiescent phenotype was characterized in C.n. from clinical, epidemiological and experimental arguments. This population would be located within a pulmonary granuloma. In parallel with the nutrient deprivation and hypoxia present in the granuloma, an in vitro protocol involving these two parameters has been developed. It allowed a biological characterization of the dormant phenotype. This population is characterized as viable but non-culturable cells (VBNC). By various proteomic approaches it has been determined signaling pathways such as mTOR and also metabolism of fatty acids where acetyl coenzyme A has a central role. Moreover, with a precursor of acetyl-coenzyme A, pantothenic acid (vitamin B5), which is also a factor of quorum sensing secreted by C.n., we have been able to make a proportion of this VBNC population culturable again. During infection, in the lung tissue, an increase in cell size is observed, these cells increasing from 5 to 7µm to titan cells (> 10 µm). However, reproducible generation of these cells was only possible during experimental infection. We set up an in vitro protocol for the generation of titan cells that allowed the study of the factors influencing their generation (host, fungus, environmental factors). The comparative genetic study made possible the link between phenotype and genotype. The use of strains from the H99 lineage, where few genetic differences have been described, have shown that the formation of titan cells depended on Lmp1, Sgf29 and Gpr4 / 5-Rim101 proteins. Then, the study of clinical isolates showed the role of Pkr1 as a negative regulator of the titan cell phenotype. During this work, the development of new models allowed to implement original approaches to study in the laboratory the phenotypic heterogeneity of C.n. with two phenotypes: dormant cells and titan cells. Our results provide new insights into the biogenesis of these phenotypes with the identification of several factors / pathways involved. The conditions identified for the generation of these phenotypes provide robust systems that could be valuable in dissecting the molecular mechanisms that underlie their generations.

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