Cytosolic bacterial subversions of mucosal immunity : a study of microfold (M) cell and enterocyte infections by S. flexneri and L. monocytogenes

Titre traduit

Evasions de l’immunité intestinale par des bactéries cytosoliques : étude d’infections de cellules microfold (M) et d’entérocytes par S. flexneri et L. monocytogenes
Résumé

Les pathogènes bactériens cytosoliques S. flexneri et L. monocytogenes échappent à l'immunité extracellulaire de la muqueuse en induisant leur entrée et leur mode de vie intracellulaire dans l'épithélium intestinal. Dans leur cellule hôte, ils peuvent rapidement s’échapper de leur vacuole d'internalisation, envahir le cytosol et éviter l’élimination par la dégradation cellulaire en se propageant directement de cellule à cellule.Afin d’initier l’invasion intestinale, ces deux pathogènes ciblent les cellules M préleveusesd'antigènes qui recouvrent les sites d'induction immunitaire. Toutefois le mode de vie de ces pathogènes dans les cellules M, le mécanisme de propagation de l'infection à partir de ce pointd’entrée vers les entérocytes voisins ainsi que le mécanisme d'évasion de l'induction de l'immunité adaptative sont très peu caractérisés. Dans cette étude, nous présentons un nouveau modèle physiologique d'infection apicale par S. flexneri de cellules M humaines in vitro, qui récapitule les étapes précoces de l'invasion de l’épithelium intestinal par le pathogène. Nous montrons qu'une population de S. flexneri est rapidement transcytosée, en 15 minutes, à travers les cellules M. Nous amenons une nouvelle approche microscopie en temps réel de l'infection des cellules M, qui révèle qu'une deuxième sous-population de bactéries induit son entrée plus tardivement dans les cellules M, accompagnée de projections membranaires apicales, suivie par une rupture vacuolaire et l’initiation de la réplication cytosoliique des bactéries dans les cellules M. Nous découvrons que S.flexneri a également la capacité de se propager des cellules M aux cellules voisines par la motilité liéeà l'actine, qui constitue la voie principale de propagation basolatérale de l'infection. En étendant notre étude à L. monocytogenes, nous observons qu’à la différence de S. flexneri, cette bactérie détourne le processus de transcytose à travers les cellules M en utilisant le facteur de virulence ActA. Cependant, nous notons que L. monocytogenes se propage dans l'épithélium exclusivement par la motilité liée à l'actine, de façon similaire à S. flexneri. Nous proposons que la subversion de la voie de transcytose au travers des cellules M et l'évitement des tissus immunitaires sous-jacents sont des caractéristiques partagées par les pathogènes cytosoliques, leur permettant d'échapper à l'induction de l'immunité adaptative.Par ailleurs, nous présentons une approche de tri basée sur la fluorescence d’entérocytes individuels aux stades successifs de l'infection par S. flexneri, combinée avec une analyse transcriptomique parPCR quantitative en multiplex. Cette méthode révèle la production de réponses distinctes chez les entérocytes hôtes en fonction de la localisation subcellulaire du pathogène. Nous observons la production d'une réponse bystander forte, impliquant de multiples voies de signalisation corrélées chez les enterocytes non infectés. De plus nous détectons la production de profils de réponses distincts chez l’hôte en fonction de la localisation vacuolaire ou cytosolique de la bactérie chez les entérocytes infectés. Nous montrons que le facteur de virulence OspF contribue à atténuer les réponses des entérocytes infectés et à perturber des voies de signalisation autrement corrélées chez l’hôte.En conclusion, nos études exposent de nouvelles stratégies de subversion immunitaire liées aux modes de vie intracellulaires de bactéries entériques cytosoliques, soulignant l'importance des cellules M dans la propagation bactérienne initiale et le détournement de l'immunité adaptative, ainsi que l'organisation et la perturbation des réponses immunitaires innées chez les entérocytes au cours de l’infection.

mots clés

Microfold cell
Single cell transcriptomics

Résumé

Cytosolic bacterial pathogens S. flexneri and L. monocytogenes subvert extracellular mucosal immunity by inducing their uptake and intracellular lifestyle in the intestinal epithelium. Within the host, they are able to rapidly escape their internalization vacuole, invade the cytosol and escape cellular degradation by spreading from cell-to-cell. Antigen sampling M cells overlying immune induction sites are targeted by these pathogens to initiate intestinal invasion. However, the intracellular lifestyle of these pathogens within M cells, the mechanism of spread of the infection toneigh boring enterocytes from this entry point and the mechanism of S. flexneri evasion of adaptive immunity is poorly characterized. We present a novel physiologic model of apical S. flexneri infection of human in vitro M cells which recapitulates the early steps of epithelial invasion. We show that a subset of S. flexneri is rapidly transcytosed, within 15 minutes, through M cells. We establish a newtime-lapse imaging approach of M cell infections, which reveals that another subset of bacteriainduces apical ruffling upon entry, vacuolar rupture and replicates within the M cells at later timepoints. Remarkably, these bacteria are able to spread from M cells to neighboring cells by actinbased-motility, which we show constitutes the main route of basolateral spreading of the infection.As we extend our study to L. monocytogenes, we observe that unlike S. flexneri, the bacterium diverts M cell transcytosis via the virulence factor ActA. However, we discover that L. monocytogenes spreads within the epithelium exclusively by actin-based motility, similar to S. flexneri. We propose that subversion of M cell transcytosis and avoidance of underlying immune tissues are features shared by cytosolic pathogens, allowing their escape from induction of adaptive immunity.In addition, we submit a pipeline of fluorescence-based single cell sorting of enterocytes atsuccessive stages of infection combined with transcriptional analysis by multiplex qPCR. This methodreveals the production of distinct responses in host enterocytes according to subcellular pathogen localizations. We observe the production of a strong bystander response involving multiplecorrelated host pathways in non-infected enterocytes. Moreover, we detect the output of distinct host response patterns according to vacuolar or cytosolic bacterial localizations in infectedenterocytes. We further show that the virulence effector OspF contributes to dampen infected host responses and disrupt otherwise correlated host signaling pathways. To conclude, our studies expose new immune subversion strategies linked to the intracellular life styles of cytosolic enteric bacteria, highlighting the importance of M cells in initial bacterial dissemination and diversion of adaptive immunity, and the organization and disruption of innate immune responses provoked in enterocytes during infection.

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