Dissection du trafic et du transport de peptidoglycanes dans des cellules humaines

Dissecting peptidoglycan trafficking and transport(ers) in human cells

• Auteur / Autrice : Christiane Brenner
• Direction : Ivo Gomperts Boneca
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 23/11/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Jost Enninga
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ivo Gomperts Boneca, Jost Enninga, Julien Royet, Francisco Garcia-del-Portillo, Régis Tournebize
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julien Royet, Francisco Garcia-del-Portillo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules -- Motilité

Peptidoglycanes

Mots clés libres

Peptidoglycane

Muropeptides muramyl-TriDAP (MTP)

Muramyl dipeptide (MDP)

Solute Carrier family (SLC)

N-Acetylglucosamine-N-Acetylmuramic acid (GlcNac-MurNAc)

CRISPR-Cas

Mfsd3

Résumé

Les fragments du peptidoglycane, les muropeptides muramyl-triDAP (MTP) et le muramyl dipeptide (MDP) sont détectés spécifiquement par les récepteurs cytosoliques du système immunitaire inné, Nod1 et Nod2, respectivement. Mais à ce jour, l’internalisation cellulaire de ces fragments, et plus particulièrement dans les cellules du colon humain, reste mal connue. Dans le but de mieux comprendre ce processus d’internalisation cellulaire, une lignée de cellules humaines du colon HT-29 a été utilisée comme modèle. Les deux récepteurs, Nod1 et Nod2 ont été décrits comme étant exprimés dans cette lignée cellulaire, ainsi que la famille du “Solute Carrier 15A“ (SLC15A) connue pour être impliquée dans le transport des MDP et MTP dans d’autres systèmes cellulaires, mais ce qui ne semble pas être le cas dans notre lignée modèle. A titre d’exemples, SLC15A1 (PEPT1) et SLC15A2 (PEPT2) sont exprimés à l’apex des cellules et transportent, en général, des di-et tripeptides dans les cellules intestinales et rénales. Les transporteurs SLC15A3 (PHT2) et SLC15A4 (PHT1) quant à eux, seraient responsables du transport des MDP et MTP, respectivement, dans les endosomes et les lysosomes. L’objectif de cette thèse était d’identifier le mécanisme d’internalisation du MDP dans les cellules HT-29. Ainsi, différents inhibiteurs des voies d’endocytose ont été utilisés dans des expériences de microscopie. Nos résultats suggèrent que la voie d’internalisation est différente de celle utilisée par la transferrine. En effet, l’internalisation du MDP est partiellement dépendante de la dynamine, une GTPase, et des protéines Rac1/Cdc42, deux Rho GTPases. Ces trois protéines sont impliquées dans l’endocytose et Rac1 joue également un rôle dans l’immunité innée. En parallèle, nous avons inactivé le gène MFSD3 par la technique CRISPR-Cas9. Ce dernier est l’homologue du gène ampG d’Escherichia coli qui transporte spécifiquement les muropeptides anhydres. MFSD3 a été proposé comme un autre transporteur de muropeptides, comme le MTP, permettant leur accès à Nod1 et Nod2. Ainsi, nous avons étudié la fonction de MFSD3. Les cellules déplétées pour MFSD3 étaient affectées dans leur prolifération et dans l’accumulation d’Acetyl-CoA. Une étude protéomique a montré l’implication de MFSD3 dans plusieurs voies de signalisation, suggérant son rôle important dans le métabolisme et, plus largement, dans l’immunité.

In the past it has been found that the peptidoglycan fragments muramyl dipeptide (MDP) and muramyl-triDAP (MTP) are specifically recognized by the cytosolic immune receptors Nod2 and Nod1, respectively. However, it is not clear, especially in intestinal and colon epithelial cells, how these fragments are internalized. HT-29, a human cell line from the colon has been stimulated with MDP-Rhodamine to decipher its uptake mechanism. HT-29 poses an interesting model for studying since it is a colonic cell line and both NOD1 and NOD2 are endogenously expressed, while the Solute Carrier Family SLC15A, that has been associated in the past with internalization of both MDP and MTP, seems to be expressed within these cells, however the transporters do not seem to have a role in transport of these fragments in this cell model. SLC15A1 (PEPT1) and SLC15A2 (PEPT2) are expressed at the apical side of cell membranes and mediate the uptake of di- and tripeptides into intestinal and renal cells, while SLC15A3 (PHT1) and SLC15A4 (PHT1) are assumed to be transporting MDP and MTP, respectively, from the early endosome and from the lysosome. One aim of this thesis was to identify the uptake-mechanism for MDP within these cells. By using different inhibitors of endocytosis in combination with microscopy, it has been found that MDP conjugated to Rhodamine is partly endocytosed by an uptake mechanism dependent on Dynamin and Rac1, two Rho GTPases. These two proteins are both involved in endocytosis and vesicular trafficking. Rac1 many different cellular processes such as gene transcription, vesicle trafficking and cytoskeleton architecture, as well as immune signaling. In addition, CRISPR-Cas9 was applied by a collaboration of the lab to knock-down MFSD3, the human homologue of the AmpG gene in E. coli that has been found to recycle murein tripeptide and transport anhydrous muropeptides required to have the disaccharide N-acetylglucosamine-N-acetylmuramic acid (GlcNac-MurNAc). It was suggested in the literature that MFSD3 thus could be another likely candidate to transport ligands to NOD1. Therefore, it was investigated what the substrate, and in general the function of MFSD3 could be. A proteomics approach was carried out and by this several interesting signaling pathways could be identified that suggest that the gene is likely to be important in metabolism and immunity.