Thèse soutenue

Développement d'une stratégie innovante de modélisation de la structure des ARN : étude des mécanismes moléculaires des IRES de type III

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Auteur / Autrice : Delphine Allouche
Direction : Bruno Sargueil
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie moléculaire
Date : Soutenance le 18/10/2018
Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
Laboratoire : Laboratoire de cristallographie et RMN biologiques / LCRB - UMR 8015
Jury : Président / Présidente : Emmanuelle Schmitt
Examinateurs / Examinatrices : Emmanuelle Schmitt, Fabrice Jossinet, Alessia Ruggieri, Laurent Chavatte, Yann Ponty
Rapporteurs / Rapporteuses : Emmanuelle Schmitt, Fabrice Jossinet

Résumé

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L'ARN est une macromolécule composée de bases azotées pouvant s'apparier entre elles et adopter diverses structures (secondaire, tertiaire). Cette structure secondaire est constituée de différents motifs comme des hélices, des boucles reliés entre-elles par des jonctions. La caractérisation de cette structure peut être réalisée au moyen de techniques biophysiques (cristallographie, RMN et Cryo-EM) mais également aux moyens de techniques biochimiques dites de « probing ». Des macromolécules biologiques (RNAses) ou de petites molécules chimiques permettent de sonder la structure de l'ARN en identifiant les nucléotides en simples brins. Parallèlement, il existe des logiciels qui, basés sur des calculs thermodynamiques, permettent de prédire les structures secondaires (RNAStructure, RNAFold...). La structure proposée correspond à la structure ayant l'énergie libre calculée la plus faible. Certains de ces logiciels peuvent utiliser les données expérimentales de probing comme contraintes afin d'améliorer la prédiction de la structure secondaire. Cependant ces prédictions restent inexactes pour des molécules de plus de 100 nucléotides, ceci notamment parce que le modèle thermodynamique est incomplet mais aussi parce qu'un ARN adopte plusieurs conformations. Partant de ce constat et en collaboration avec le Dr Ponty, la première partie de ma thèse a été consacrée au développement de nouvelles stratégies de modélisation de la structure secondaire des ARN. Cette méthode est basée sur des expériences de multi-probing sur un ARN de référence original : le ribozyme de Didymium iridis. D'après le modèle obtenu par diffraction aux rayons X, cet ARN possède de nombreux appariements non canoniques (appariements rarement prédit par les logiciels de prédiction), plusieurs pseudonoeuds et existe sous la forme de deux conformères. Une première stratégie qui permet d'élaborer un modèle à partir de données expérimentales multiples été développée et évaluée. Ensuite, une banque de mutants a été créée et sondée afin d'améliorer les algorithmes la prédiction des structures et surtout pour détecter les conformations alternatives. La seconde partie de ma thèse est dédiée à l'étude des mécanismes moléculaires des IRES de type III. Les IRES (Site d'Entrée Interne des Ribosomes) sont des structures présentes dans la région 5' non traduite (5'UTR) ou dans les régions intergéniques de certains ARN cellulaires ou viraux. Ces structures permettent le recrutement de la machinerie traductionnelle directement ou à proximité du codon initiateur. Les IRES sont classés en quatre catégories en fonction de leur structure et des facteurs cellulaires nécessaires au recrutement de la machinerie traductionnelle. Les IRES de type III dont le chef de file est l'IRES du virus de l'hépatite C (HCV) possèdent des structures stables dans la région 5'UTR organisées en trois domaines et recrute un faible nombre de facteurs de l'initiation (eIFs). D'autres virus comme ceux de de la peste classique du porc (CSFV), Seneca Valley (SVV) ou le virus des frontières (BDV) possèdent des IRES semblables à l'exception d'un sous-domaine supplémentaire appelé IIId2. Le rôle de ce sous domaine n'est pas clair, en collaboration avec plusieurs équipes nous avons étudié son impact sur la traduction et la réplication de ces virus.