Membrane échangeur de cation inorganique à BBB : focus sur le transport du lithium et les canaux TRPV dans les cellules endothéliales cérébrales humaines

Membrane exchangers of inorganic cations at the human blood-brain barrier : focus on lithium transport and TRPVs channels in human brain endothelial cells

• Auteur / Autrice : Huilong Luo
• Direction : Xavier Declèves
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacocinétique
• Date : Soutenance le 10/10/2018
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Paris Descartes (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Catherine Marchand
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Catherine Marchand, Jean-François Ghersi-Egea, Stéphane Sebille, Armelle Biola-Vidamment, Frank Bellivier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-François Ghersi-Egea, Stéphane Sebille

Mots clés

Mots clés contrôlés

Effets des médicaments

Barrière hématoencéphalique

Cellules endothéliales

Membranes échangeuses d'ions

Transport physiologique

Lithium

Mots clés libres

Sodium transporter

Lithium

TRPV

Cannabidiol

Blood-Brain barrier

Résumé

Dans un premier temps, nous avons exploré l'effet du lithium sur l'expression des ARNs des transporteurs et des enzymes de métabolisation dans les cellules hCMEC / D3. Notre étude a montré que le traitement par chlorure de lithium (LiCl) à 10 mM augmente les ARNm de la claudin-3, du transporteur ABCG2, du CYP1A1 et de la glutathion-S-transférase GSTM3, tandis que d'autres marqueurs de la BHE n'ont pas été significativement modifiés. Par la suite, nous avons étudié les transporteurs de sodium dans l'influx de lithium dans les cellules endothéliales cérébrales. Cette étude a porté sur l'étude de certains transporteurs sodiques (NHE (SLC9), NBC (SLC4) et NKCC (SLC12)). L'expression génique des transporteurs de Na+ dans les cellules hCMEC / D3, les modèles BBB dérivés de cellules hématopoïétiques humaines (HBLEC) et les cellules endothéliales cérébrales humaines primaires (hPBMEC) ont montré l'ordre suivant concernant leur niveau d'expression: NHE1> NKCC1> NHE5> NBCn1 tandis que les ARNs NHE2, NHE3, NHE4, NBCn2, NBCe1 et NBCe2 ont été à peine détectés. L'absence de Na+ dans le milieu d'incubation a augmenté d'un facteur 3 l'influx de Li+ dans les cellules D3. Les inhibiteurs de transport sodiques de type DMA (inhibiteur NHE), DIDS (inhibiteur des transporteurs anioniques) et bumétanide (inhibiteur NKCC) ont diminué respectivement de façon significative l'influx de Li+ de 52%, 51% et 47% dans les cellules D3, tandis que le S0859 (inhibiteur NBC) l'augmentait significativement d'un facteur 2,3. Le zoniporide (inhibiteur de NHE1) et l'extinction de l'expression de NHE1 par siRNA n'ont eu aucun effet sur l'influx de Li+ par les cellules D3. Notre étude montre que les transporteurs NHE1 et / ou NHE5, NBCn1 et NKCC1 jouent un rôle significatif dans l'influx de Li + dans des cellules endothéliales cérébrales et suggère qu'ils peuvent être des biomarqueurs de la réponse des patients au lithium. L'expression fonctionnelle des canaux TRP de la sous-famille vanilloïdes (TRPV) et leur rôle dans la l'influx Ca2+ dans les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux (BMEC) formant la barrière hémato-encéphalique (BBB) ont été mal étudiés. Par qRt-PCR, nos travaux ont montré des niveaux importants d'ARNs de TRPV2 dans la lignée D3 et dans des cultures primaires de cellules endothéliales cérébrales humaines issues de patients. L'expression protéique élevée de TRPV2 a été confirmée par Western blot et par immunofluorescence notamment au niveau de la membrane plasmique des cellules D3. L'augmentation du Ca2+ intracellulaire induite par TRPV2 a été montré par une stimulation thermique et bloquée par un inhibiteur non-spécifique des TRPVs, le rouge de ruthénium (RR) et par l'inhibiteur spécifique de TRPV2, le tranilast (TNL). Le cannabidiol (CBD), un agoniste TRPV2 de haute affinité, induit une augmentation durable de Ca2+ qui est aboli par le RR ou le TNL. Le CBD induit de manière dose-dépendante la prolifération des cellules D3 avec une CE50 de 0,3 ± 0,1 µM, et inhibée par le TNL ou l'extinction du TRPV2 par siRNA. La prolifération cellulaire a été significativement réduite de 31% dans les cellules dont l'expression en TRPV2 a été réduite en utilisant une stratégie efficace de siRNA. Un test de migration cellulaire (would healing) a montré que la migration cellulaire induite par le CBD était inhibée par le siRNA TRPV2 et le TNL. La tubulogenèse des cellules D3 dans le matrigel a également été significativement augmentée de 41% et de 73% après 7h ou 24h de traitement au CBD, et abolie par le TNL ou le siRNA TRPV2. Nos résultats démontrent que l'activation de TRPV2 induit la prolifération cellulaire et la migration, la tubulogenèse et TEER des cellules. Ces résultats suggèrent que le TRPV2 pourrait être une cible pharmacologique lorsque la BHE est altérée pour la réparer.

First, we explored the effect of Lithium on mRNA expression of transporters and metabolizing enzymes in hCMEC/D3 cells. Our study showed that LiCl treatment for 6 days at a concentration of 10 mM induced transcription of the TJ protein claudin-3, the ABC transporter BCRP/ABCG2, the cytochrome p-450 CYP1A1 and the glutathione-S-transferase GSTM3, whereas the other selected markers were not significantly affected. Our findings provide new insights into the effects of lithium on some drug transporters and drug-metabolizing enzymes in the BBB that may have consequences in pharmacotherapy. Second, we found that sodium transporters are involved in lithium influx in brain endothelial cells. This study deciphers Li+ transport at the BBB focusing on Na+-coupled transporters (NHE (SLC9), NBC (SLC4) and NKCC (SLC12)). The BBB permeability of Li+ evaluated in the rat was 2% that of high passive diffusion compounds. Gene expression of Na+-coupled transporters in hCMEC/D3 cells, human hematopoetic stem cells-derived BBB models (HBLEC) and human primary brain microvascular endothelial cells (hPBMEC) showed the following rank order with close expression profile: NHE1 > NKCC1 > NHE5 > NBCn1 while NHE2, NHE3, NHE4, NBCn2, NBCe1 and NBCe2 mRNA were barely detected. Na+ depletion increased Li+ uptake by 3.3-fold in hCMEC/D3 and Li+ permeability through HBLECs monolayers by 1.6-fold. DMA (NHE inhibitor), DIDS (anionic carriers inhibitor) and bumetanide (NKCC inhibitor) decreased significantly the uptake of Li+ by hCMEC/D3 by 52%, 51% and 47%, respectively while S0859 (NBC inhibitor) increased significantly the uptake of Li+ by 2.3-fold. Zoniporide (NHE1 inhibitor) and siRNA interference against NHE1 had no effect on Li+ uptake by hCMEC/D3 cells. Li+ permeability through HBLEC was significantly increased by DIDS, bumetanide, S0859 and zoniporide. Our study suggests that NHE1 and/or NHE5, NBCn1, and NKCC1 may play a significant role in the Li+ transport across the human BBB and be putative variability factors of Li+ response. Third, we found that cannabidiol increases proliferation, migration and tubulogenesis of hCMEC/D3 human cerebral microvessel endothelial cells through TRPV2 activation. The functional expression of transient receptor potential vanilloid channels (TRPV) and their role in Ca2+ dynamics in brain microvessel endothelial cells (BMEC) forming the blood-brain barrier (BBB) have been poorly investigated. Using q-RTPCR abundant TRPV2 mRNA levels in the human BBB cell line hCMEC/D3 and in primary cultures of BMEC from patient brain biopsies were found. High protein expression of TRPV2 was confirmed by western blotting and immunofluorescence in the plasma membrane and intracellular compartments of hCMEC/D3 cells. TRPV2-mediated increase in intracellular Ca2+ was triggered by heat stimulation and blocked by the wide TRPVs inhibitor ruthenium red (RR) and the TRPV2 inhibitor tranilast (TNL). Cannabidiol (CBD), a high-affinity TRPV2 agonist, induced a long-lasting increase in intracellular Ca2+ abolished by RR or TNL. CBD dose-dependently induced hCMEC/D3 cell proliferation with an EC50 of 0.3±0.1 µM, and inhibited by TNL or silencing TRPV2. Cell proliferation was significantly reduced by 31% in cells silenced for TRPV2 using efficient siRNA strategy. Wound healing assay showed that CBD-induced cell migration which was inhibited by TNL or TRPV2 siRNA. The tubulogenesis of hCMEC/D3 cells in matrigel was also significantly increased by 41% and 73% after 7h or 24h CBD treatment, respectively, and abolished by TNL or TRPV2 siRNA. Finally, CBD increased the transendothelial electrical resistance (TEER) of monolayers of primary human endothelial cells cultured in transwell experiments. Our results demonstrate that activation of TRPV2 induces cell proliferation and migration, tubulogenesis and TEER of human BBB endothelial cells and could be a new target for modulating the BBB.